Este manuscrito descreve o procedimento experimental e análise de software para um ensaio de site de integração bidirecional que pode simultaneamente analisar DNA de junção vetor-hospedeiro a montante e a jusante. Os produtos de PCR bidirecionais podem ser usados para qualquer plataforma de seqüência a jusante. Os dados resultantes são úteis para uma comparação quantitativa de alto rendimento de alvos de DNA integrados.
Os ensaios do Site de Integração (IS) são um componente crítico do estudo dos sites de integração retroviral e sua importância biológica. Nos recentes estudos de terapia de genes retrovirais, os ensaios de IS, em combinação com a sequenciação da próxima geração, foram utilizados como ferramenta de rastreamento celular para caracterizar as populações de células-tronco clonais que compartilham o mesmo IS. Para a comparação precisa de repetir os clones de células-tronco dentro e entre diferentes amostras, a sensibilidade de detecção, a reprodutibilidade dos dados e a capacidade de alto rendimento do ensaio estão entre as qualidades de ensaio mais importantes. Este trabalho fornece um fluxo de trabalho detalhado de análise de dados e dados para a análise IS bidirecional. O ensaio bidirecional pode simultaneamente seqüenciar junções vetor-host a montante e a jusante. Comparado com as abordagens convencionais de seqüenciamento IS unidirecional, a abordagem bidirecional melhora significativamente as taxas de detecção de IS e a caracterização de eventos de integração em ambas as extremidades de tEle alvo DNA. O encanamento de análise de dados descrito aqui identifica e enumera com precisão as seqüências IS idênticas através de várias etapas de comparação que mapeiam as seqüências IS no genoma de referência e determinam erros de seqüenciamento. Usando um procedimento de ensaio otimizado, publicamos recentemente os padrões de repovoamento detalhados de milhares de clones de células estaminais hematopoiéticas (HSC) após transplante em macacos rhesus, demonstrando pela primeira vez o ponto de tempo preciso do repovoamento de HSC e a heterogeneidade funcional de HSCs no Sistema de primatas. O protocolo a seguir descreve o procedimento experimental passo a passo e fluxo de trabalho de análise de dados que identifica e quantifica precisamente as seqüências IS idênticas.
Retroviruses inserem seu DNA genômico no genoma do hospedeiro em vários locais. Esta propriedade única, que pode contribuir para o desenvolvimento de cânceres e outras formas de patogênese viral, tem o benefício irônico de tornar esses vírus altamente acessíveis à engenharia celular para terapia genética e pesquisa de biologia básica. O site de integração viral (IS) – a localização no genoma do hospedeiro onde um DNA estrangeiro (vírus) está integrado – tem implicações importantes para o destino dos vírus integrados e das células hospedeiras. Os ensaios IS foram utilizados em várias configurações de pesquisa biológica e clínica para estudar a seleção do site de integração retroviral e patogênese, desenvolvimento do câncer, biologia das células-tronco e biologia do desenvolvimento 1 , 2 , 3 , 4 . Baixa sensibilidade de detecção, baixa reprodutibilidade de dados e freqüente contaminação cruzada estão entreOs principais fatores que limitam as aplicações dos ensaios IS aos estudos atuais e planejados.
Muitas tecnologias de análise IS foram desenvolvidas. Os ensaios de locais de integração baseados em enzimas de restrição, incluindo a Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) 5 , a PCR inversa 6 e o PCR 7 da Medição Lineada por Amplificação (LAM), são os mais amplamente utilizados. O uso de enzimas de restrição específicas do site, no entanto, gera um viés durante a recuperação do IS, permitindo apenas um subconjunto de integromes (um DNA estrangeiro integrado no genoma do hospedeiro) na proximidade do site de restrição a ser recuperado 4 . As tecnologias de ensaio que avaliam mais detalhadamente o vetor IS também foram introduzidas nos últimos anos. Esses ensaios empregam várias estratégias, incluindo o PCR 8 mediado por Transposon, não restritivo (nr) -LAM PCR 9 , enzima de restrição do tipo II-mDigestão editada 10 , cisalhamento mecânico 11 e PCR aleatória baseada em hexâmero (Re-free PCR) 12 , para fragmentar DNAs genômicos e amplificar IS. As tecnologias atuais têm níveis variáveis de sensibilidade de detecção, cobertura de genoma, especificidade de alvo, capacidade de alto rendimento, complexidade de procedimentos de teste e vies na detecção de frequências relativas de sites alvo. Dadas as diferentes qualidades dos ensaios existentes e a variedade de propósitos para os quais eles podem ser usados, a abordagem de ensaio ideal deve ser cuidadosamente selecionada.
Este trabalho fornece procedimentos experimentais detalhados e um fluxo de trabalho de análise de dados computacionais para um ensaio bidirecional que melhora significativamente as taxas de detecção e a precisão da quantificação da seqüência ao analisar simultaneamente o IS a montante e a jusante do DNA alvo integrado (ver Figura 1 para uma visão esquemática dos procedimentos de ensaio ). Esta abordagem também forneceS os meios para caracterizar o processo de integração retroviral (por exemplo, a fidelidade da duplicação do site alvo e as variações nas seqüências genômicas das inserções a montante e a jusante). Outros métodos bidirecionais foram utilizados principalmente para clonagem e seqüenciamento de ambas as extremidades do DNA alvo 11 , 13 , 14 . Este ensaio é amplamente otimizado para a quantificação de alto rendimento e reproduzível de clones marcados por vetores, utilizando o método de LM-PCR bem estabelecido e o mapeamento de análise computacional e para quantificar as junções a montante e a jusante. A análise bidirecional com a enzima TaqαI provou ser útil para quantificação clonal de alto rendimento em estudos pré-clínicos de terapia de células-tronco 2 , 15 . Este artigo descreve um método modificado usando um cortador mais freqüente (RsaI / CviQI – motivo: GTAC) que dobra tAs chances de detectar integromes em comparação com um teste baseado em TaqαI . Procedimentos detalhados de análise experimental e de dados que utilizam as enzimas do motivo GTAC para o lentiviral (NL4.3 e suas derivadas) e as análises do vector IS da gama-retroviral (vetores pMX) são descritas. Os oligonucleótidos utilizados no ensaio estão listados na Tabela 1 . Um script de programação interno para análise de seqüência IS é fornecido no documento suplementar.
O ensaio bidirecional permite a análise simultânea de ambas as sequências de junção de DNA do vetor do vetor a montante (esquerda) e a jusante (direita) e é útil em uma série de aplicações de terapia genética, células-tronco e pesquisa de câncer. O uso de enzimas com motivo GTAC (RsaI e CviQI) e a abordagem de PCR bidirecional melhora significativamente as chances de detectar um integrome (ou uma população clonal) quando comparado aos ensaios baseados em enzimas de TCGA-padrão ( TaqαI ) <sup cl…
The authors have nothing to disclose.
O financiamento foi fornecido pelos Institutos Nacionais de Subsídios de Saúde R00-HL116234, U19 AI117941 e R56 HL126544; O National Science Foundation Grant DMS-1516675; Fundação Nacional de Pesquisa da Coréia (NRF-2011-0030049, NRF-2014M3C9A3064552); E o programa de iniciativa KRIBB.
Thermostable DNA polymerase | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase |
Thermostable DNA polymerase buffer | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase buffer |
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix | New England Biolabs | N0447L | dNTP solution mix (10mM each) |
PCR tubes | VWR International | 53509-304 | PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps |
2ml microcentrifuge tube | Molecular Bioproducts | 3453 | microcentrifuge tubes |
PCR purification kit | Qiagen | 28106 | |
RsaI | New England Biolabs | R0167L | restriction enzyme |
CviQI | New England Biolabs | R0639L | restriction enzyme |
Buffer A | New England Biolabs | B7204S | NEB CutSmart buffer |
DNA Polymerase I large (klenow) fragment | New England Biolabs | M0210L | Blunting |
streptavidin beads solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
Binding Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
Washing Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
magnetic stand | ThermoFisher | 12321D | DynaMag™-2 Magnet |
T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | T4 DNA ligase |
10X T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | T4 DNA ligase reaction buffer |
5X T4 DNA ligase buffer | Invitrogen | 46300-018 | T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000 |
UV-Vis spectrophotometer | Fisher Scientific | S06497 | Nanodrop 2000 |
pvuII | new England Biolabs | R0151L | restriction enzyme |
sfoI | new England Biolabs | R0606L | restriction enzyme |
Buffer B | new England Biolabs | B7203S | NEB buffer 3.1 |
Nuclease free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-14 | |
Capillary electrophoresis | Qiagen | 9001941 | QIAxcel capillary electrophoresis |
Veriti 96-well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4375305 | PCR Instrument |
Rotating wheel (or Roller) | Eppendorf | M10534004 | Cell Culture Roller Drums |
DNA size marker | Qiagen | 929559 | QX size marker (100-2,500 bp) |
DNA size marker | Qiagen | 929554 | QX size marker (50-1,500 bp) |
DNA alignment markers | Qiagen | 929524 | QX DNA Alignment Marker |
genomc DNA | Not Available | Not Available | Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments |