Tvåriktad retroviral integrationsplats PCR-metodik och kvantitativ dataanalys arbetsflöde
Summary
Detta manuskript beskriver experimentell procedur och mjukvaruanalys för en dubbelriktad integreringsställeanalys som samtidigt kan analysera uppströms och nedströms vektor-värd-kryssnings-DNA. Tvåriktiga PCR-produkter kan användas för någon nedströms sekvenseringsplattform. Den resulterande data är användbar för en hög genomströmning, kvantitativ jämförelse av integrerade DNA-mål.
Abstract
Integration Site (IS) analyser är en kritisk komponent i studien av retrovirala integrationsställen och deras biologiska betydelse. I de senaste retrovirala genterapistudierna har IS-analyser, i kombination med nästa generationens sekvensering, använts som ett cellspårningsverktyg för att karakterisera klonala stamcellspopulationer som delar samma IS. För den korrekta jämförelsen av repopulerande stamcellkloner inom och över olika prover är detektionens känslighet, dataframtagbarhet och hög genomströmningskapacitet hos analysen bland de viktigaste analysegenskaperna. Det här arbetet ger ett detaljerat protokoll- och dataanalys-arbetsflöde för dubbelriktad IS-analys. Tvåriktningsanalysen kan samtidigt sekvensera både uppströms och nedströms vektor-värdkryssningar. Jämfört med konventionella enriktade IS-sekvenseringsmetoder, förbättrar dubbelriktat tillvägagångssätt signifikant IS-detekteringshastigheter och karakteriseringen av integrationshändelser i båda ändarna av tHan riktar sig mot DNA. Dataanalyspipelinjen som beskrivs här identifierar och summerar identiska IS-sekvenser genom flera steg för jämförelse som kartlägger IS-sekvenser på referensgenomet och bestämmer sekvenseringsfel. Med hjälp av ett optimerat analysförfarande har vi nyligen publicerat detaljerade återuppbyggnadsmönster av tusentals hematopoetiska stamceller (HSC) efter transplantation i rhesusmakar, vilket för första gången demonstrerar den exakta tidpunkten för HSC-repopulationen och den funktionella heterogeniteten hos HSCs i Primatsystem. Följande protokoll beskriver steg för steg experimentell procedur och dataanalys arbetsflöde som exakt identifierar och kvantifierar identiska IS-sekvenser.
Introduction
Retrovirus sätter in deras genomiska DNA i värdgenomet på olika ställen. Denna unika egenskap, som kan bidra till utvecklingen av cancer och andra former av viral patogenes, har en ironisk fördel att göra dessa virus mycket mottagliga för cellteknik för genterapi och grundbiologiforskning. Viral Integration Site (IS) – placeringen på värdgenomet där ett främmande DNA (virus) integreras – har viktiga konsekvenser för ödet för både de integrerade virusen och värdcellerna. IS-analyser har använts i olika biologiska och kliniska forskningsinställningar för att studera retroviralt integrationsställsval och patogenes, cancerutveckling, stamcellsbiologi och utvecklingsbiologi 1 , 2 , 3 , 4 . Låg detekteringskänslighet, dålig datareproducerbarhet och frekvent korsförorening är blandNyckelfaktorerna begränsar användningen av IS-analyser till aktuella och planerade studier.
Många IS-analystekniker har utvecklats. Restriktionsenzymbaserade integrationsstadsanalyser, inklusive Linker-medierad (LM) polymerasekedjereaktion (PCR) 5 , invers PCR 6 och linjärförstärkningsmedierad (LAM) PCR 7 är de mest använda. Användningen av platsspecifika restriktionsenzymer genererar emellertid en bias vid återhämtningen av IS, vilket möjliggör endast en delmängd integrerade (ett främmande DNA integrerat i värdgenomet) i närheten av restriktionsstället som skall återvinnas 4 . Analysteknik som mer omfattande utvärderar vektor IS har också introducerats de senaste åren. Dessa analyser använder olika strategier, innefattande Mu transposon-medierad PCR 8 , icke-restriktiv (nr) -LAM PCR 9 , typ II-restriktionsenzym-mEdierad digestion 10 , mekanisk skjuvning 11 och slumpmässig hexamerbaserad PCR (Re-free PCR) 12 , för fragmentering av genomiska DNA och amplifiering av IS. Nuvarande tekniker har varierande nivåer av detekteringskänslighet, genomdäckning, målspecificitet, hög genomströmningskapacitet, analysprocedurernas komplexitet och förspänningar vid detektering av de relativa frekvenserna hos målplatserna. Med tanke på de olika egenskaperna hos de befintliga analyserna och de olika syften för vilka de kan användas, bör den optimala analysmetoden noggrant väljas.
Detta arbete tillhandahåller detaljerade experimentella förfaranden och ett arbetsdata för databasanalys för en dubbelriktad analys som avsevärt förbättrar detekteringshastigheten och sekvenskvantifieringsnoggrannheten genom att samtidigt analysera IS uppströms och nedströms om det integrerade mål-DNA (se Figur 1 för en schematisk bild av analysprocedurerna ). Detta tillvägagångssätt ger ocksåS medel för att karakterisera den retrovirala integrationsprocessen (till exempel trovärdigheten för målplats duplicering och variationer i de genomiska sekvenserna av uppströms och nedströms införingar). Andra bidirektionsmetoder har använts huvudsakligen för kloning och sekvensering av båda ändarna av mål-DNA 11 , 13 , 14 . Denna analys optimeras i stor utsträckning för hög genomströmning och reproducerbar kvantifiering av vektormärkta kloner, med användning av den väletablerade LM-PCR-metoden och kartläggning av analysanalys och för kvantifiering av både uppströms och nedströms förbindelser. Tvåriktningsanalys med TaqaI- enzymet har visat sig vara användbart för högklassig klonal kvantifiering i prekliniska studier av stamcellsgeneration 2 , 15 . I detta dokument beskrivs en modifierad metod med en frekventare skärare (RsaI / CviQI – motiv: GTAC) som dubblerar tHan chanser att detektera integrer jämfört med en Taqal- baserad analys . Detaljerade experimentella och data analysmetoder som använder GTAC-motiv enzymer för lentivirala (NL4.3 och dess derivat) och gamma-retrovirala (pMX vektorer) vektor IS-analys beskrivs. De oligonukleotider som användes vid analysen är listade i tabell 1 . Ett internt programmeringsskript för IS-sekvensanalys finns i kompletteringsdokumentet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tvåriktningsanalysen möjliggör samtidig analys av både uppströms (vänster) och nedströms (höger) vektor-värd-DNA-förbindningssekvenser och är användbar i ett antal genterapi-, stamceller- och cancerforskningsapplikationer. Användningen av GTAC-motiv-enzymer (RsaI och CviQI) och det dubbelriktade PCR-förfarandet förbättrar signifikant chanserna för detektering av en integrom (eller en klonal population) jämfört med tidigare TCGA-motiv-enzym ( Taqal ) -baserade analyser <sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiering tillhandahölls av National Institutes of Health Grants R00-HL116234, U19 AI117941 och R56 HL126544; National Science Foundation Grant DMS-1516675; Koreas nationella forskningsstiftelse (NRF-2011-0030049, NRF-2014M3C9A3064552); Och KRIBB-initiativprogrammet.
Materials
| Thermostable DNA polymerase | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase |
| Thermostable DNA polymerase buffer | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase buffer |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix | New England Biolabs | N0447L | dNTP solution mix (10mM each) |
| PCR tubes | VWR International | 53509-304 | PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps |
| 2ml microcentrifuge tube | Molecular Bioproducts | 3453 | microcentrifuge tubes |
| PCR purification kit | Qiagen | 28106 | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167L | restriction enzyme |
| CviQI | New England Biolabs | R0639L | restriction enzyme |
| Buffer A | New England Biolabs | B7204S | NEB CutSmart buffer |
| DNA Polymerase I large (klenow) fragment | New England Biolabs | M0210L | Blunting |
| streptavidin beads solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Binding Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Washing Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| magnetic stand | ThermoFisher | 12321D | DynaMag™-2 Magnet |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | T4 DNA ligase |
| 10X T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | T4 DNA ligase reaction buffer |
| 5X T4 DNA ligase buffer | Invitrogen | 46300-018 | T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000 |
| UV-Vis spectrophotometer | Fisher Scientific | S06497 | Nanodrop 2000 |
| pvuII | new England Biolabs | R0151L | restriction enzyme |
| sfoI | new England Biolabs | R0606L | restriction enzyme |
| Buffer B | new England Biolabs | B7203S | NEB buffer 3.1 |
| Nuclease free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-14 | |
| Capillary electrophoresis | Qiagen | 9001941 | QIAxcel capillary electrophoresis |
| Veriti 96-well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4375305 | PCR Instrument |
| Rotating wheel (or Roller) | Eppendorf | M10534004 | Cell Culture Roller Drums |
| DNA size marker | Qiagen | 929559 | QX size marker (100-2,500 bp) |
| DNA size marker | Qiagen | 929554 | QX size marker (50-1,500 bp) |
| DNA alignment markers | Qiagen | 929524 | QX DNA Alignment Marker |
| genomc DNA | Not Available | Not Available | Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments |
References
- Serrao, E., Engelman, A. N. Sites of Retroviral DNA Integration: From Basic Research to Clinical Applications. Crit. Rev. Biochem. Mol. Bio. 51 (1), 26-42 (2016).
- Kim, S., et al. Dynamics of HSPC Repopulation in Nonhuman Primates Revealed by a Decade-Long Clonal-Tracking Study. Cell Stem Cell. 14 (4), 473-485 (2014).
- Bushman, F. Retroviral integration and human gene therapy. J. Clin. Invest. 117 (8), 2083-2086 (2007).
- Bystrykh, L. V., Verovskaya, E., Zwart, E., Broekhuis, M., de Haan, G. Counting stem cells: methodological constraints. Nat Meth. 9 (6), 567-574 (2012).
- Schröder, A., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110 (4), 521-529 (2002).
- Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. J. Virol. 64, 3150 (1990).
- Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat. Meth. 4 (12), 1051-1057 (2007).
- Brady, T., et al. A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy. Nucleic Acids Res. 39 (11), e72 (2011).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Kim, S., Kim, Y., Liang, T., Sinsheimer, J., Chow, S. A high-throughput method for cloning and sequencing human immunodeficiency virus type 1 integration sites. J. Virol. 80 (22), 11313-11321 (2006).
- Maldarelli, F., et al. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345 (6193), 179-183 (2014).
- Wu, C., et al. High Efficiency Restriction Enzyme-Free Linear Amplification-Mediated Polymerase Chain Reaction Approach for Tracking Lentiviral Integration Sites Does Not Abrogate Retrieval Bias. Hum. Gene. Ther. 24 (1), 38-47 (2013).
- Aker, M., Tubb, J., Miller, D. G., Stamatoyannopoulos, G., Emery, D. W. Integration Bias of Gammaretrovirus Vectors following Transduction and Growth of Primary Mouse Hematopoietic Progenitor Cells with and without Selection. Mol. Ther. 14 (2), 226-235 (2006).
- Gabriel, R., Kutschera, I., Bartholomae, C. C., von Kalle, C., Schmidt, M. Linear Amplification Mediated PCR; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA. J Vis Exp. (88), e51543 (2014).
- Kim, S., et al. High-throughput, sensitive quantification of repopulating hematopoietic stem cell clones. J. Virol. 84 (22), 11771-11780 (2010).
- Mitchell, R., et al. Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences. PLoS Biol. 2 (8), e234 (2004).
- Melkus, M., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).
- Bystrykh, L. V. A combinatorial approach to the restriction of a mouse genome. BMC Res Notes. 6, 284 (2013).
- Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. -. P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods Mol Biol. , 321-344 (2014).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Qin, X., An, D., Chen, I., Baltimore, D. Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (1), 183-188 (2003).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Exp. Hematol. 31 (11), 1007-1014 (2003).
- Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326 (5954), 818-823 (2009).
