Enkelt att använda arkitekturer i Protein-baserade hydrogeler för Cell kultur applikationer
Summary
Olika metoder för att manipulera tredimensionella arkitektur i protein-baserade hydrogels utvärderas här avseende materialegenskaper. Avdunsta nätverken är functionalized med en cell-lim-peptid och deras genomförbarhet i cellkultur utvärderas med hjälp av två olika modell cell linjer.
Abstract
Hydrogeler redovisas som lovande material för cell kultur tillämpningar på grund av deras förmåga att tillhandahålla mycket hydrerad cell miljöer. Fältet för 3D mallar ökar på grund av den potentiella likheten mellan dessa material till naturliga extracellulärmatrix. Protein-baserade hydrogeler är särskilt lovande eftersom de kan enkelt vara functionalized och kan uppnå definierade strukturer med justerbar fysikalisk-kemiska egenskaper. Produktionen av får 3D mallar för cell kultur program som använder naturliga material begränsas dock ofta av deras svagare mekaniska egenskaper jämfört med de av syntetiska material. Här, olika metoder utvärderades för att producera avdunsta bovint serumalbumin (BSA)-baserade hydrogel system, med en justerbar porstorlek i intervallet 10 till 70 µm i radie. Dessutom inrättades en metod att generera kanaler i detta protein-baserade material som flera hundra mikrometer lång. De olika metoderna att producera porer, liksom påverkan av porstorlek på materialets egenskaper såsom svullnad baserat, pH, temperaturstabilitet och enzymatiska nedbrytningen beteende, analyserades. Porstorlek undersöktes i den infödda, svullna delstaten den hydrogels använder confocal microscopy för laserscanning. Genomförbarheten för cell kultur program utvärderades med hjälp av en cell-självhäftande RGD peptid modifiering av protein och två modell cellinjer: mänskliga bröstcancer cancerceller (A549) och adenocarcinomic human alveolär basala epitelceller (MCF7).
Introduction
Hydrogeler är material som bildar olösliga 3D nätverk kan bindande stora mängder vatten. Sådant material kan ge utmärkta miljöförhållanden för levande celler. För närvarande, det finns ett ökat intresse i generationen av tredimensionella hydrogel strukturer och i utveckling av processer för att skräddarsy deras kemiska och fysikaliska egenskaper. När detta är uppnått, kan en mall för tillväxten av celler och manipulering av cellulära beteende vara genererade1,2,3,4. Dessa 3D-strukturer inte bara skapa en mer naturlig och realistisk miljö än konventionella tvådimensionell metoder, men de också avslöja nya möjligheter för tillväxt av stamceller eller tumör modeller5. Olika material besitter en rad egenskaper som främst är beroende av porstorlek av gel6. Porerna har en avgörande roll i cell kultur program, vävnadsteknik och riktad tillväxt av stamceller. Till exempel syre och näringsämnen diffunderar genom matrisen och tillräckliga mängder måste kunna nå de celler7. Å andra skadliga metaboliter måste tas bort så snabbt som möjligt och tillräckligt med utrymme för cellernas tillväxt måste vara tillgängliga7. Följaktligen, egenskaperna för materialet, och därmed porstorlek, allvarligt påverka de potentiella nytta och möjliga tillämpningarna av matrisen. Beroende på egenskaperna hos materialet, kan olika cell-tillväxt processer uppstå i 3D cellodling, däribland bildandet av neuronala strukturer. tillväxt och differentiering av celler i huden eller ben; och riktad tillväxt av särskilda stamcellslinjer, som hepatocyter eller fibroblaster2,3,8,9,10,11. En annan avgörande punkt påverkar en eventuell tillämpning av ett material är dess stabilitet mot yttre stimuli12. Till exempel måste hydrogel bibehålla sin mekanisk integritet i cell kulturmassmedia eller den mänskliga kroppen.
Under senare år har forskning om 3D cell kultur hydrogels intensifieras, och många studier genomfördes till lösa de 3D arkitekturerna av system13. Hydrogeler består av kemiskt syntetiserade komponenter undersöks oftast eftersom de kan enkelt syntetiseras och kemiskt modifierade och de uppvisar hög stabilitet (se Zhu et al., 2011 för en granskning)5. Proteiner har dock många välgörande egenskaper: som so-called ”precision polymers”, de är biokompatibla; de har en definierad längd; de är relativt lätta att ändra; och de har ett stort antal mål platser14,15. I detta avseende kan mycket specifika, innovativa strukturer genereras för tillämpning inom många områden. I denna studie användes en protein-baserade hydrogel16 att demonstrera förmågan av väletablerade metoder att påverka materialet 3D arkitektur. Dessutom undersöktes också den förmåga och tillämplighet till pore generation.
Det finns många olika tekniker att ändra 3D-strukturer, inklusive både enkla metoder och sofistikerade, högt specialiserade tekniker från olika områden inom materialvetenskap. En utbredd teknik är användningen av electrospinning att generera väl definierade strukturer17. Laddade fibrer dras från en lösning av ett elektriskt fält och sedan stelna vid exponering för syre. På detta sätt kan fibrer i spänna av flera nanometer upp till flera mikrometer produceras. Ytterligare tekniker att justera storlek, struktur och fördelning av porerna inom matrisen är mjuk litografi, photolithography, hydrodynamisk fokusering, electro-sprutning och bio-utskrift18,19,20. En betydande nackdel med dessa tekniker är deras beroendeställning specifika, dyr utrustning och särskilda kemikalier eller material. Dessutom erfarenhet med dessa tekniker är ofta inte direkt överföras till protein-baserade material, och många av de kemikalier och metoder är inte cell kompatibel.
Å andra sidan, lita många tekniker inte på särskild utrustning, göra dem enklare och billigare att tillämpa och att reproducera. En utbredd metod för struktur manipulation är lösningsmedel gjutning21,22,23. Partiklar läggs före polymerisation reaktionen och distribueras likartad för att mätta lösningen. Efter polymerisation leder en förändring av villkor, såsom en utspädning eller en pH förändring, till utläggning av partiklarna, medan porerna förblir inom materialet. Kemikalier som används i dessa tekniker, såsom salt, socker, paraffin, gelatin och krita, är billiga och lätt tillgängliga. I frystorkning, är svullna hydrogeler frysta. Den efterföljande sublimering av de flytande faserna under en vakuum är sedan utförs23,24,25. Vatten sublimering från nätverket är skonsam nog att bibehålla särskilda 3D-strukturer av materialet. I gasar skumbildning, direktuppspelas en lösning med en gas medan polymerisation sker, lämnar porer inom gel21. Storleken och fördelningen av porerna kan justeras beroende på gasströmmen.
För att bilda den protein hydrogel, är BSA reagerade med tetrakis (hydroximetyl) phosphonium chloride (THPC) i en Mannich-typ reaktion att möjliggöra bildandet av kovalenta bindningar mellan primära aminer och hydroxy grupper av fyra beväpnade linker molekyl26. Möjligt skadligt intermediärer avlägsnas genom överdriven tvättning av materialet efter reaktionen inträffar.
Denna studie visar möjligheten att behandla en BSA-baserat material med olika tekniker för att manipulera och anpassa storleken på porerna. Var och en av teknikerna som kan användas i alla laboratorier över hela världen, som ingen särskild utrustning är nödvändiga. Dessutom olika parametrar, såsom svullnad baserat, enzymatisk nedbrytbarhet, pH stabiliteten och temperatur känslighet, undersökts och förhållande till varandra, särskilt med avseende på påverkan av de olika teknikerna på generationen av 3D arkitekturer. Slutligen, material var functionalized med cell-självhäftande peptider för att undersöka en eventuell tillämpning av material till cellkultur. Två olika modell cellinjer användes: A549 och MCF7.
Protocol
Representative Results
Discussion
The production of macroporous matrices can be beneficial to many different fields. It has high technical and economic potential due to the defined structure of the hydrogel and the ability to control and tune specific material properties. However, the introduction of supramolecular structural elements, such as pores or channels, to a 3D template might influence the overall properties of a material, such as the swelling ratio or the stiffness. This can result in the undesired decomposition, degradation, or breakdown of th…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Baden-Württemberg Stiftung för deras finansiella stöd inom ramen för ”Bioinspired Material syntes” (BioMatS-14).
Materials
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (high glucose) | Life Technologies / Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies / Thermo Fisher | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies / Thermo Fisher | 15140122 | |
| MEM Nonessential Amino Acid Solution | Sigma Aldrich | M7145-100ML | |
| Trypsin EDTA 0.05 % Phenol Red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 | |
| Ethanol 99.8 %, vergällt | Ölfabrik Schmidt | 2133 | |
| NaCl | Carl Roth | 9265.1 | |
| Albumin Fraction V | Carl Roth | 3854.2 | |
| THPC | Sigma Aldrich | 404861-100ML | Toxic |
| 0.1 % Triton X 100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | Slightly toxic |
| Phalloidin-rhodamine | Life Technologies / Thermo Fisher | R415 | |
| 3.7 % Formaldehyde | Life Technologies / Thermo Fisher | F8775-25ML | Toxic |
| Rhodamine B | Sigma Aldrich | 81-88-9 | |
| Filtropur S 0.2, | Sarsted Ag und Co. | 2 83.1826.001 | |
| µ slide 8 well | Ibidi GmbH | 80826 | |
| KCSSGKSRGDS peptide | UPEP Ulm | Custom sysnthesis | |
| Ethanol 99.8 %, vergällt | Carl Roth | K928.5 | |
| Falcon 5 ml Polysterene Round-Bottom Tube | Sarsted Ag und Co. | 62.547.254 | |
| Tubes 50 ml | Sarsted Ag und Co. | 62.547.254 | |
| Tubes 1,5 ml | Sarsted Ag und Co. | 72,690,001 | |
| Tubes 2 ml | Sarsted Ag und Co. | 72,691 | |
| CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM | Greiner | 655073 | |
| FreezeDryer Epsilon 1-6D, | Christ, Osterode am Harz, Germany | ||
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | ||
| Zen Software Version 2012 Sp1, black edition, 407 version 8,1,0,484 | Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | ||
| GSA Imaga Analyzer Software, GSA Image Analyzer, GSA, Version 419 3.8.7 | GSA GmbH |
References
- Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirki, U. Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics. Nanomedicine. 5 (3), 469-484 (2011).
- Liu, Y., Chan-Park, M. B. A biomimetic hydrogel based on methacrylated dextran-graft-lysine and gelatin for 3D smooth muscle cell culture. Biomaterials. 31 (6), 1158-1170 (2010).
- Raic, A., Rödling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).
- Wong Po Foo, C. T. S., Lee, J. S., Mulyasasmita, W., Parisi-Amon, A., Heilshorn, S. C. Two-component protein-engineered physical hydrogels for cell encapsulation. Proc Nat Acad Sci USA. 106 (52), 22067-22072 (2009).
- Zhu, J., Marchant, R. E. Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds. Expert Rev Med Devic. 8 (5), 607-626 (2011).
- Samaryk, V., et al. Versatile Approach to Develop Porous Hydrogels with a Regular Pore Distribution and Investigation of their Physicomechanical Properties. J Appl Polym Sci. 114 (4), 2204-2212 (2009).
- Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 4 (12), 1509-1525 (2012).
- Park, H., Guo, X., et al. Effect of Swelling Ratio of Injectable Hydrogel Composites on Chondrogenic Differentiation of Encapsulated Rabbit Marrow Mesenchymal Stem Cells In Vitro. Biomacromolecules. 10 (3), 541-546 (2010).
- Stokols, S., Tuszynski, M. H. The fabrication and characterization of linearly oriented nerve guidance scaffolds for spinal cord injury. Biomaterials. 25 (27), 5839-5846 (2004).
- Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. 8 (10), 1-13 (2013).
- Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection. J Neurotrauma. 21 (6), 789-804 (2004).
- Shoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: An in vitro comparison of alginate and agarose. Biotechnol Bioeng. 50 (4), 374-381 (1996).
- Chiu, Y. -. C., Kocagöz, S., Larson, J. C., Brey, E. M. Evaluation of physical and mechanical properties of porous poly (ethylene glycol)-co-(L-lactic acid) hydrogels during degradation. PloS One. 8 (4), e60728 (2013).
- Jonker, A. M., Löwik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Peptide- and Protein-Based Hydrogels. Chem Mater. 24 (5), 759-766 (2012).
- Bodenberger, N., et al. Beyond bread and beer: whole cell protein extracts from baker’s yeast as a bulk source for 3D cell culture matrices. Appl Microbiol Biot. 101 (5), 1-11 (2016).
- Bodenberger, N., Paul, P., Kubiczek, D., Walther, P., Gottschalk, K. E., Rosenau, F. A novel cheap and easy to handle protein hydrogel for 3D cell culture applications a high stability matrix with tunable elasticity and cell adhesion properties. Chem Sel. 1 (7), 1353-1360 (2016).
- Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).
- Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues. Biome Mater. 5 (2), 21001 (2010).
- Jayasinghe, S. N., Irvine, S., McEwan, J. R. Cell electrospinning highly concentrated cellular suspensions containing primary living organisms into cell-bearing threads and scaffolds. Nanomedicine. 2 (4), 555-567 (2007).
- Selimović, &. #. 3. 5. 2. ;., Oh, J., Bae, H., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. Microscale strategies for generating cell-encapsulating hydrogels. Polymers. 4 (3), 1554-1579 (2012).
- Annabi, N., Nichol, J. W., et al. Controlling the porosity and microarchitecture of hydrogels for tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. 16 (4), 371-383 (2010).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 61-86 (2008).
- Bodenberger, N., et al. Evaluation of methods for pore generation and their influence on physio-chemical properties of a protein based hydroge. Biotech Rep. 12, 6-12 (2016).
- Raja, S. T. K., Thiruselvi, T., Mandal, A. B., Gnanamani, A. pH and redox sensitive albumin hydrogel: A self-derived biomaterial. Sci Rep. 5, 15977 (2015).
- Hennink, W. E., van Nostrum, C. F. Novel crosslinking methods to design hydrogels. Adv Drug Deliver Rev. 64, 223-236 (2012).
- Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Tetrakis(hydroxymethyl) phosphonium chloride as a covalent cross-linking agent for cell encapsulation within protein-based hydrogels. Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2008).
- Caló, E., Khutoryanskiy, V. V. Biomedical applications of hydrogels: A review of patents and commercial products. Eur Polym J. 65, 252-267 (2015).
- Huang, H., Herrera, A. I., Luo, Z., Prakash, O., Sun, X. S. Structural transformation and physical properties of a hydrogel-forming peptide studied by NMR, transmission electron microscopy, and dynamic rheometer. Biophys J. 103 (5), 979-988 (2012).
- Draghi, L., Resta, S., Pirozzolo, M. G., Tanzi, M. C. Microspheres leaching for scaffold porosity control. J Mater Sci. 16 (12), 1093-1097 (2005).
- Whang, K., et al. Engineering Bone Regeneration with Bioabsorbable Scaffolds with Novel Microarchitecture. Tissue Eng. 5 (1), 35-51 (1999).
- Ziv, K., et al. A tunable silk-alginate hydrogel scaffold for stem cell culture and transplantation. Biomaterials. 35 (12), 3736-3743 (2014).
- Butruk-Raszeja, B. A., et al. Athrombogenic hydrogel coatings for medical devices–Examination of biological properties. Colloid Surface B. 130, 192-198 (2015).
- Lü, S., Li, B., Ni, B., Sun, Z., Liu, M., Wang, Q. Thermoresponsive injectable hydrogel for three-dimensional cell culture: chondroitin sulfate bioconjugated with poly(N-isopropylacrylamide) synthesized by RAFT polymerization. Soft Matter. 7 (22), 10763 (2011).
- Ruoslahti, E., Pierschbacher, M. D. New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins. Science. 238 (4826), 491-497 (1987).
