Expansão e adipogênese Indução de progenitores de adipócitos do tecido adiposo perivascular isolado pela classificação de células ativadas magnéticas
Summary
Aqui, relatamos um método para o isolamento das populações de células progênitentes de adipócitos (APC) do tecido de tecido adiposo perivascular (PVAT) usando a classificação celular celular ativada por magnética (MCS). Este método permite um maior isolamento de APC por grama de tecido adiposo quando comparado à Classificação de células ativadas por fluorescência (FACS).
Abstract
A expansão do Texo Adiposo Perivascular (PVAT), um importante regulador da função vascular através da sinalização paracrina, está diretamente relacionada ao desenvolvimento da hipertensão durante a obesidade. A extensão da hipertrofia e hiperplasia depende da localização do depósito, do sexo e do tipo de fenótipos da célula progenitora de adipócitos (APC) presente. As técnicas utilizadas para APC e isolamento de pré-adipitos nos últimos 10 anos melhoraram drasticamente a precisão em que as células individuais podem ser identificadas com base em marcadores de superfície celular específicos. No entanto, o isolamento de APC e adipócitos pode ser um desafio devido à fragilidade da célula, especialmente se a célula intacta deve ser retida para aplicações de cultura de células.
A Classificação Celular ativada por magnética ( MCS) fornece um método para isolar um maior número de APC viável por unidade de peso de tecido adiposo. O APC colhido pelo MCS pode ser usado para protocolos in vitro para expandir a preaOs dipócitos e diferenciá-los em adipócitos através do uso de coquetéis de fatores de crescimento, permitindo a análise do potencial prolífico e adipogênico retido pelas células. Este experimento centrou-se nos depósitos de PVAT aórtica e mesentérica, que desempenham papéis fundamentais no desenvolvimento de doenças cardiovasculares durante a expansão. Esses protocolos descrevem métodos para isolar, expandir e diferenciar uma população definida de APC. Este protocolo MCS permite que o isolamento seja usado em qualquer experiência onde a classificação celular seja necessária com equipamento ou treinamento mínimo. Essas técnicas podem auxiliar experimentos adicionais para determinar a funcionalidade de populações de células específicas com base na presença de marcadores de superfície celular.
Introduction
O Texo Adiposo Perivascular (PVAT), devido à sua proximidade com os vasos sanguíneos, é um importante componente de sinalização paracrina na função vascular 1 . A expansão deste tecido adiposo é dependente do fenótipo das células progenitoras de adipócitos (APC) presentes 2 , 3 . O isolamento de células de tecidos adiposos é difícil, pois os adipócitos primários são frágeis, flutuantes e variam em tamanho. Certas técnicas de isolamento também podem alterar o fenótipo e a morfologia celular aumentando a síntese de proteínas inflamatórias e reduzindo a expressão genética adipogênica 4 , enfatizando a importância de um protocolo que mantenha a integridade das células.
A cultura de células primárias e subpopulações específicas de pré-adipócitos dá uma abordagem reducionista ao crescimento in vivo e mantém uma composição genética celular equivalente 5 , embora funcioneEu com estas células é limitado devido a deterioração com o envelhecimento, ou senescência 6 . Os pré-adipócitos de vários depósitos adiposos, incluindo depósitos subcutâneos e omental, também demonstram diferenças na proliferação 7 , o que enfatiza a importância de coletar células de locais anatômicos específicos. As células precursoras de depósitos adiposos brancos não PVAT foram caracterizadas em estudos anteriores 7 , 8 , 9 , mas menos conhece-se sobre os fenótipos de PVAT APC.
As técnicas aqui descritas permitem a análise de populações de APC específicas e definidas com impacto mínimo na morfologia, viabilidade e potencial de proliferação e diferenciação. A classificação de células ativadas por magnética (MCS) é passível de aplicações a jusante, como a cultura, à medida que as contas se dissolvem sem alterar a célula. MCS também é econômico, e uma vez que o anticorpoAs centralizações foram padronizadas, a necessidade de ensaios de citometria de fluxo é mínima. Estudos in vitro com precursores de PVAT também podem dar um vislumbre do potencial que essas células primárias podem ter.
Protocol
Representative Results
Discussion
O foco central do presente experimento é o isolamento, expansão e adição adipogênica de APC de depósitos de PVAT. Aqui apresentamos um protocolo para o isolamento de APC com base na identificação de células que expressam os marcadores de superfície CD34 e PDGFRα. Estas proteínas de superfície foram previamente identificadas em APC com altas taxas de proliferação e o potencial para se diferenciar em adipócitos brancos ou marrons em vários depósitos adiposos 14 , <sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os laboratórios Contreras e Watts e o Dr. William Raphael. Essas experiências foram suportadas por NHLBI F31 HL128035-01 (padronização do protocolo de digestão tecidual), NHLBI 5R01HL117847-02 e 2P01HL070687-11A1 (animais) e NHLBI 5R01HL117847-02 (isolamento e cultura de células).
Materials
| Tissue Dissection | |||
| Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
| Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 | Kit |
| Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | |
| Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | |
| Splinter Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | |
| Tissue Scissors | George Tiemann & Co | 105-400 | |
| KRBB Solution | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 7758-114 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| Antibiotic/Antimicotic | Corning | 30-004-CI | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Tissue Digestion | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | 1X Working Solution |
| Water Bath | Thermo-Fisher Scientific | 2876 | Reciprocal Shaking Bath |
| Biosafety Cabinet | Thermo-Fisher Scientific | 1385 | |
| Rotisserie Incubator | Daigger | EF4894C | |
| 100 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-549 | Yellow |
| 40 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-547 | Blue |
| Hemocytometer | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Cell Isolation | |||
| OctoMACS Kit | Miltenyi Biotech | 130-042-108 | |
| (DMEM):F12 Medium | Corning | 90-090 | Medium Base |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35016CV | USA Origins |
| Normal Donkey Serum | AbCam | AB7475 | |
| Anti-CD34 | Santa Cruz | SC-7324 | FITC conjugated |
| Anti-PDGFRα | Thermo-Fisher Scientific | PA5-17623 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-007-003 | |
| PBS 10X | Corning | 46-013-CM | 1X Working Solution |
| EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
| Cell Culture | |||
| CO2 Cell Incubator | Thermo-Fisher Scientific | 51030285 | Heracell 160i |
| 6-Well Plates | Corning | 3516 | TC-Treated |
| 48- Well Plates | Corning | 3548 | TC-Treated |
| 96-Well Plates, Black Wall | Corning | 353376 | TC-Treated |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | TC-Treated |
| Fetal Calf Serum | Corning | 35011CV | USA Origins |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | 50-81-7 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | 58-85-5 | |
| Pantothenate | Sigma-Aldrich | 137-08-6 | |
| L-Glutamine | Corning | 61-030 | |
| Bone Morphogenic Protein 4 | Prospec Bio | CYT-081 | |
| Epidermal Growth Factor | PeproTech | 400-25 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | PeproTech | 250-02 | |
| Platelet-derived Growth Factor BB | Prospec Bio | CYT-740 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 450-33 | |
| Insulin | Corning | 25-800-CR | ITS Solution |
| IBMX | Sigma-Aldrich | 28822-58-4 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | 50-02-2 | |
| T3 (Triiodothyronine) | Sigma-Aldrich | 6893-023 | |
| Cell Analysis | |||
| CyQUANT Proliferation Assay | Thermo-Fisher Scientific | C7026 | |
| AdipoRed Fluorescence Assay Reagent | Lonza | PT-7009 | |
| Oil Red O Lipid Dye Reagent | Sigma-Aldrich | O1391 | In Solution |
| M1000 Microplate Reader | Tecan | ||
| Eclipse Inverted Microscope | Nikon | ||
| Digital Sight DS-Qil Camera | Nikon |
References
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