Formålet med denne protokol er at skitsere indsamling og behandling af humane kirurgiske prøver til flere downstream-applikationer i vestibulær schwannoma og Schwann-cellet forskning.
Vestibulære schwannomer er de mest almindelige neoplasmer af cerebellopontinvinklen og udgør 6-8% af alle intrakraniale vækst. Skønt disse tumorer forårsager sensorineurelt høretab i op til 95% af de ramte individer, forbliver de molekylære mekanismer, der ligger til grund for dette høretab, unnvikende. Denne artikel beskriver de trin, der er etableret i vores laboratorium for at lette indsamling og behandling af forskellige primære humane vævsprøver til downstream-forskningsapplikationer, der er integreret i studiet af vestibulære schwannomer. Specifikt beskriver dette værk en samlet metodologisk ramme for indsamling, behandling og kultur af Schwann- og schwannomaceller fra kirurgiske prøver. Dette er integreret med parallelle behandlingstrin, der nu betragtes som afgørende for nuværende forskning: indsamling af tumor- og nervesekretioner, bevaring af RNA og ekstraktion af protein fra indsamlede væv, fiksering af væv til fremstilling af sektioner, enD eksponering af primære humane celler til adeno-associerede vira til anvendelse på genterapi. Desuden fremhæver dette arbejde den translabyrintiske kirurgiske tilgang til at samle denne tumor som en unik mulighed for at opnå menneskelig sensorisk epithel fra det indre øre og periliem. Der gives tips til forbedring af eksperimentelle kvalitet og almindelige faldgruber fremhævet.
Vestibulære schwannomer (VS'er) er de mest almindelige neoplasmer af cerebellopontinvinklen, diagnosticeret hos 1 ud af hver 100.000 individer. Selvom ikke-metastatisk, påvirker disse tumorer alvorligt en patients livskvalitet 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Berørte personer lever normalt med høretab, tinnitus og en følelse af lydhørhed. Symptomer bliver mere og mere svækkende, da tumoren vokser, hvilket skaber balanceproblemer, ansigtslamper og svækkelse af andre kraniale nervefunktioner. Livstruende komplikationer som følge af hjernestamme kompression kan også resultere 7 .
Forvaltningsmuligheder for VS er i det væsentlige begrænset til vågent venter på statiske tumorer og stereotaktisk strålebehandling eller kirurgisk resektion for voksende tumorer <sUp class = "xref"> 8. Den kirurgiske fjernelse af disse tumorer i forskningsrelaterede hospitaler giver mulighed for at erhverve og analysere frisk tumorvæv indsamlet under patientoperationer. En specifik kirurgisk tilgang til VS, den translabyrintiske resektion, kan endda give adgang til værdifulde menneskelige sensoriske epitel fra det indre øre og periliem.
Fordi VS'er stammer fra en perifer sensorisk nerve ( dvs. den vestibulære nerve), er det vigtigt at sammenligne VS-associerede observationer med dem, der stammer fra en passende kontrolnerve, såsom den humane store aurikulære nerve (GAN). Friske GAN'er aflives regelmæssigt under parotidektomi eller halsdissektioner og kan bruges som robuste modeller til sund Schwann-cellefysiologi 9 .
Fordi der ikke findes FDA-godkendte lægemidler til behandling eller forebyggelse af sporadisk VS, er det afgørende, at forskere belyser den underliggende molekylære mechaSygdomme af sygdommen for at identificere terapeutiske mål. Proteiner, der har vist sig at spille en rolle i VS-patogenesen, omfatter merlin, vaskulær endothelial vækstfaktor (VEGF), cyclooxygenase 2 (COX-2), nuklear faktor kappa B (NF-KB), tumornekrosefaktor alfa (TNF-alpha) , Epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR) og beslægtede signalmolekyler 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .
Nylige fremskridt har udvidet og forbedret protokoller til indsamling, behandling, kultur og efterfølgende undersøgelse af primære humane vestibulære schwannomer og sunde nervevæv 18 , 19 . Imidlertid er de fleste eksisterende protokoller designet til at rumme forberedelsenAtion af sådanne væv til en enkelt downstreamforskning ( dvs. cellekultur alene). Denne artikel præsenterer en samlet metodologisk ramme for samtidig behandling af en enkelt primær human VS- eller GAN-prøve til flere downstream-applikationer: celletypespecifik kultur, proteinekstraktion, RNA-konservering, tumorsekretionsopsamling og vævsfiksering. Dette arbejde beskriver også kirurgisk indsamling og behandling af human cerebrospinalvæske (CSF) og perilymph under translabyrint VS-resektion, da disse nært beslægtede væv kan tjene som vigtige kilder til biomarkører til VS. Endelig præsenterer denne protokol trin for viral transduktion af primære humane VS-celler i kultur som en ny anvendelse af dette væv til anvendelse i genterapi.
Dette manuskript beskriver en samlet metodologisk ramme for VS-forskning, der beskriver samtidig behandling af humane VS- og GAN-prøver til downstream-forskningsapplikationer. Da VS-forskning går i en alder af præcisionsmedicin, kan det være muligt at opdage molekylære, cellulære, genetiske og proteomiske indsigter, som er specifikke for de enkelte patienter, når man forbereder den samme prøve i formularer, der kan svare på talrige forskningsspørgsmål.
Renheden af humane Sch…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Institute of Dovenhed og andre kommunikationsforstyrrelser tilskud R01DC015824 (KMS) og T32DC00038 (støtte JES og SD), Department of Defense grant W81XWH-14-1-0091 (KMS), Bertarelli Foundation (KMS) , Nancy Sayles Day Foundation (KMS), Lauer Tinnitus Research Center (KMS) og Barnes Foundation (KMS).
BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12mm #1 German Glass Coverslip | Corning | 354087 | Or prepare coverslips with Corning Laminin (CB-40232) and Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01) |
CELLSTAR 15 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
CELLSTAR 50 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum, Sterile-filtered | Sigma-Aldrich | C1639 | |
Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates, Sterile | Corning | 3526 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
DMEM/F-12, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
Dumont #3 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11231-30 | Autoclave prior to use |
Dumont #5 Forceps, Standard tip, Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | Autoclave prior to use |
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 ml tubes and store in -20°C freezer |
Hyaluronidase from Bovine Testes, Type I-S, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | H3506 | |
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, sterile | EMD Millipore | SLGP033RS | |
Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
PBS, pH 7.4, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml), 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Tablets | Roche | 04906845001 | |
Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88666 | |
Pipettes and pipette tips, 5/10/25 ml | Variable | Variable | |
Plastic Homogenization Pestle for 1.5/2.0ml Microtubes | E&K Scientific | EK-10539 | |
PrecisionGlide Needles, 27 G x 1 1/2 in | BD | 301629 | |
RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
RNAlater (RNA stabilization solution) | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 ml | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 ml | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
Saline – 0.9% Sodium Chloride Injection, bacteriostatic, 20 ml | Hospira | 0409-1966-05 | |
Scalpel Blades – #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
Schuknecht Suction Tube 24 gauge | Bausch + Lomb | N1698 42 | Useful for the surgical approach (in addition to common otologic surgical instruments) and e.g. a blue surgical marker |
Specimen Container, OR sterile, 4OZ | Medline | DYND30331H | |
Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
Syringe/Needle Combination, Luer-Lok Tip, 5 ml, 22 G x 1 in. | BD | 309630 | |
Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 1 ml | BD | 309659 | |
Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 3 ml | BD | 309656 | |
Ultrasonic homogenizer, 4710 Series, CV18 probe | Cole-Parmer | CP25013 |