前庭シュワン細胞腫研究のための統一方法論的枠組み

Summary

このプロトコールの目的は、前庭神経鞘腫およびシュワン細胞研究における複数の下流適用のためのヒト外科用サンプルの収集および処理を概説することである。

Abstract

前庭神経鞘腫は、脳脊髄の角度の最も一般的な新生物であり、すべての頭蓋内成長の6-8％を占める。これらの腫瘍は、冒された個体の最大95％において感音難聴を引き起こすが、この難聴の根底にある分子メカニズムは依然として分かり難い。この資料では、前庭神経鞘腫の研究に不可欠な下流の研究アプリケーションのための様々な初代ヒト組織サンプルの収集と処理を容易にするために、私たちの研究室で確立された手順を概説します。具体的には、この研究は、外科用試料からのシュワン細胞およびシュワン細胞腫細胞の収集、処理および培養のための統一された方法論的枠組みを記載する。これは、現在の研究にとって不可欠である平行処理工程と統合されています：腫瘍および神経分泌の収集、RNAの保存および収集された組織からのタンパク質の抽出、切片の調製のための組織の固定、d遺伝子療法への適用のためのアデノ随伴ウイルスへの一次ヒト細胞の曝露。さらに、この研究は、内耳および外リンパからヒトの感覚上皮を得る独特な機会として、この腫瘍を採取するためのトランスアラインメント手術アプローチを強調している。実験的品質を改善するためのヒントが提供され、一般的な落とし穴が強調表示されます。

Introduction

前庭神経鞘腫（VS）は小脳門角の最も一般的な新生物であり、10万人に1人と診断されている。非転移性ではあるが、これらの腫瘍は、患者の生活の質に1,2,3,4,5,6に深刻な影響を与える。冒された個人は、通常、難聴、耳鳴り、および聴覚充満の感覚で生きる。腫瘍が成長するにつれて症状がますます衰弱し、バランスの問題、顔面の麻痺、および他の脳神経機能の障害を引き起こす。脳幹圧迫による生命を脅かす複雑な合併症も起こり得る⁷ 。

VSの管理オプションは、本質的に静的腫瘍および定位放射線療法または成長する腫瘍のための外科的切除を待つことに制限されている<sup class = "xref"> 8。研究関連病院におけるこれらの腫瘍の外科的除去は、患者の外科手術中に収集された新鮮な腫瘍組織を取得し、分析する機会を提供する。 translabrinthine切除であるVSに対する1つの特定の外科的アプローチは、内耳および外リンパからの貴重なヒト感覚上皮へのアクセスを提供することさえできる。

VSは末梢感覚神経（ すなわち、前庭神経）から生じるので、VS関連の観察を、人間の大耳神経（GAN）などの適切な制御神経から得られたものと比較することが重要である。健康なGANは、胸腺摘除術または頸部切開の間に定期的に屠殺され、健康なシュワン細胞生理学の頑強なモデルとして使用することができる⁹ 。

散発性VSの治療または予防のためのFDA認可の薬物は存在しないため、研究者は根底にある分子メカニズムを解明することが不可欠です治療標的を同定するために疾患の病因を同定する。 VEGF、シクロオキシゲナーゼ2（COX-2）、核因子κB（NF-κB）、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）、胃腸管壊死因子α（TNF-α）などのVS病因に役割を果たすことが示されているタンパク質は、 、表皮成長因子受容体（EGFR）、および関連するシグナル伝達分子10,11,12,13,14,15,16,17が含まれる。

最近の進歩は、初代ヒト前庭神経鞘腫および健康な神経組織の収集、処理、培養、および下流の調査のためのプロトコールを拡大および改良した^18,19 。しかし、ほとんどの既存のプロトコルは、単一の下流の研究適用（ すなわち、細胞培養のみ）のためのそのような組織の導入。この記事では、細胞型特異的培養、タンパク質抽出、RNA保存、腫瘍分泌回収、および組織固定など、複数の下流アプリケーションのための単一の初代ヒトVSまたはGANサンプルの同時処理のための統一された方法論的フレームワークを提示します。これらの密接に関連した組織は、VSに対するバイオマーカーの重要な供給源として役立つ可能性があるので、この研究は、トランスアライントリンVS切除の間のヒト脳脊髄液（CSF）および外リンパ球の外科的採取および処理について詳述する。最後に、このプロトコールは、遺伝子治療に使用するためのこの組織の新規適用として、培養における初代ヒトVS細胞のウイルス形質導入のためのステップを提示する。

Protocol

手術前にすべてのサンプルを収集するための書面による同意が得られ、実験は世界医師会（ヘルシンキ宣言）の倫理規定に従って実施された。研究プロトコールのすべてのセクションは、マサチューセッツ州眼科学部審査委員会、マサチューセッツ総合病院によって承認された。 注：以下のセクション1-7は、手術室からの一次ヒトVSまたはGANサンプルの受領時に順次実行…

Representative Results

セクション5で確立されているように、培養中の初代ヒトVS細胞は、多くの下流の研究アプリケーション（ 図1 ）において疾患関連プロセスの有益なモデルとして扱うことができる。第6節で培養された健康なシュワン細胞は、直接的で教示的な比較点を提供する。以下に概説するように、統一された方法論的フレームワークに従って処理されたVS?…

Discussion

この原稿は、VS研究のための統一された方法論的枠組みを記述し、下流の研究の応用のためにヒトVSとGAN標本の同時処理を概説している。 VS研究が精密医学の時代に入っても、多数の研究問題に答えることができる形で同じサンプルを調製することで、個々の患者に特有の分子、細胞、遺伝子、プロテオームの洞察を発見することができます。

ヒトSchwann細胞およびVS培養?…

Materials

BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12mm #1 German Glass Coverslip	Corning	354087	Or prepare coverslips with Corning Laminin (CB-40232) and Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01)
CELLSTAR 15 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile	Greiner Bio-One	188161
CELLSTAR 50 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile	Greiner Bio-One	227261
CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 mm	Greiner Bio-One	628160
Collagenase from Clostridium histolyticum, Sterile-filtered	Sigma-Aldrich	C1639
Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates, Sterile	Corning	3526
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 ml	Thermo Fisher Scientific	10313-039
DMEM/F-12, 500 ml	Thermo Fisher Scientific	11320-033
Dumont #3 Forceps, Dumoxel	Fine Science Tools	11231-30	Autoclave prior to use
Dumont #5 Forceps, Standard tip, Inox	Fine Science Tools	11251-20	Autoclave prior to use
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 ml	Thermo Fisher Scientific	10437-028	Aliquot in 50 ml tubes and store in -20°C freezer
Hyaluronidase from Bovine Testes, Type I-S, Lyophilized Powder	Sigma-Aldrich	H3506
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, sterile	EMD Millipore	SLGP033RS
Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline	Sigma-Aldrich	P6148	Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online
PBS, pH 7.4, 500 ml	Thermo Fisher Scientific	10010-023	Autoclave prior to use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml), 100 ml	Thermo Fisher Scientific	15140-122
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Tablets	Roche	04906845001
Pierce Protease Inhibitor Tablets	Thermo Fisher Scientific	88666
Pipettes and pipette tips, 5/10/25 ml	Variable	Variable
Plastic Homogenization Pestle for 1.5/2.0ml Microtubes	E&K Scientific	EK-10539
PrecisionGlide Needles, 27 G x 1 1/2 in	BD	301629
RIPA Buffer	Boston BioProducts	BP-115
RNAlater (RNA stabilization solution)	Thermo Fisher Scientific	AM7021
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 ml	Eppendorf	022363719	Autoclave prior to use
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 ml	Eppendorf	022363204	Autoclave prior to use
Saline – 0.9% Sodium Chloride Injection, bacteriostatic, 20 ml	Hospira	0409-1966-05
Scalpel Blades – #15	Fine Science Tools	10015-00
Schuknecht Suction Tube 24 gauge	Bausch + Lomb	N1698 42	Useful for the surgical approach (in addition to common otologic surgical instruments) and e.g. a blue surgical marker
Specimen Container, OR sterile, 4OZ	Medline	DYND30331H
Stemi 2000-C Stereo Microscope	Zeiss	000000-1106-133
Syringe/Needle Combination, Luer-Lok Tip, 5 ml, 22 G x 1 in.	BD	309630
Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 1 ml	BD	309659
Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 3 ml	BD	309656
Ultrasonic homogenizer, 4710 Series, CV18 probe	Cole-Parmer	CP25013