Visualisering af Axonal Projeksionsmønsteret af Embryoniske Motor Neuroner i<em> Drosophila</em

Summary

Dette arbejde beskriver en standard immunohistokemi metode til at visualisere motor neuron projiceringer af sen fase-16 Drosophila melanogaster embryoner . Det fileterede præparat af faste embryoner farvet med FasII-antistof giver et kraftfuldt værktøj til at karakterisere de gener, der kræves til motorisk axon pathfinding og målgenkendelse under neurale udvikling.

Abstract

Oprettelsen af ​​funktionelle neuromuskulære kredsløb afhænger af præcise forbindelser mellem udviklende motoraxoner og målmuskler. Motorneuroner forlænger vækstkeglerne til at navigere langs specifikke veje ved at reagere på et stort antal axon-vejledende signaler, der stammer fra det omgivende ekstracellulære miljø. Vækstkegle-målgennemgang spiller også en kritisk rolle i neuromuskulær specificitet. Dette arbejde præsenterer en standard immunhistokemi protokol til visualisering af motor neuron projiceringer af sen fase-16 Drosophila melanogaster embryoner . Denne protokol indeholder et par vigtige trin, herunder en genotypeprocedure, for at sortere de ønskede mutante embryoner; En immunfarvningsfremgangsmåde til mærkning af embryoner med fasciclin II (FasII) antistof; Og en dissektionsprocedure for at fremstille fileterede præparater fra faste embryoner. Motoraxon fremspring og muskelmønstre i periferien er meget bedre visualiseret i flade præparater af fileterede embryoner end i whOle-mount embryoner. Derfor giver det fileterede præparat af faste embryoner farvet med FasII-antistof et kraftfuldt værktøj til at karakterisere de gener, der kræves til motorisk axon pathfinding og målgenkendelse, og det kan også anvendes til både funktionssvigt og forstærkningsgenetiske skærme .

Introduction

Præcise og selektive forbindelser mellem motorakser og målmuskler under embryonal udvikling er afgørende for normal bevægelse i Drosophila larver. Den embryonale mønster på 30 muskelfibre i hver af de abdominale hemisegmenter A2-A7 er etableret ved trin 16 ¹ . De 36 motorneuroner, der genereres i den ventrale nervesnor, strækker deres axoner ind i periferien for at innervate specifikke muskler ² . Motor-axon-pathfinding og målgenkendelse kan visualiseres ved immunhistokemi med et antistof (musmonoklonalt antistof 1D4) ^{3 , 4} . Flere billeder af motorens axonfremspringsmønstre i vildtypeembryoner er tilgængelige på nettet ⁵ . 1D4-antistoffet mærker alle motoraxoner og tre langsgående aksonfasikaler på hver side af midterlinjen af ​​det embryonale centralnervesystem (CNS) ⁴ </sOp> ^{, 6} ( figur 1C og figur 2A ). Derfor tilvejebringer immunhistokemi med FasII-antistof et kraftfuldt værktøj til at identificere gener, der kræves til neuromuskulær tilslutning til demonstration af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for motor-axon-vejledning og målgenkendelse.

I hver af de abdominale hemisegmenter A2-A7 projekterer motoriske axoner og selektivt fasciculerer i to hovednervenafsnit, segmentnerven (SN) og den tværsegmentale nerve (ISN) ^{2 , 4} og en mindre nerveafdeling, tværsnerven (TN ) ⁷ . SN defektiverer selektivt for at give anledning til to nervegrene kaldet SNa og SNc, hvorimod ISN'en opdeles i tre nervegrene kaldet ISN, ISNb og ISNd ^{2 , 4} . Blandt dem er ISN, ISNb og SNa motoraxonProjiceringsmønstre visualiseres mest præcist, når sent stadium-16 embryoner farves med FasII antistof og er fileteret ( Figur 1C og Figur 2A ). ISN-motorneuronerne udvider deres axoner til indervate dorsale muskler 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 og 20 ^{2 , 4} ( figur 2A ). ISNb-motorneuronerne inderverer ventrolaterale muskler 6, 7, 12, 13, 14, 28 og 30 ^{2 , 4} ( figur 2A og 2B). SNa-nerveafdelingen projekterer at innervere laterale muskler 5, 8, 21, 22, 23 og 24 ^{2 , 4} ( figur 2A ). TN'en, som består af to motoraxoner, projekterer ipsilateralt langs segmentgrænsen til den indre muskel 25 og gør synapser med den laterale bipolære dendritiske neuron (LBD) iPeriferien ⁷ ( figur 2A ). Disse mål muskelinnervationer kræver ikke kun selektiv defaskulering af motoraxoner på bestemte valgpunkter, men også målrettet mod muskelgenkendelse. Derudover findes nogle formodede mesodermale vejledningsceller, der virker som mellemmål, både i ISN- og SNa-stierne, men ikke langs ISNb-stien ⁴ . Dette kan tyde på, at ISNb motor axon pathfinding kan reguleres på en særskilt måde i forhold til ISN og SNa motor axon vejledning, og det indikerer også, at perifer motor axon vejledning giver en attraktiv eksperimentel model til at studere differentierede eller konserverede roller i en enkelt vejledning cue Molekyle ⁸ .

Dette arbejde præsenterer en standard metode til at visualisere de axonale fremskrivningsmønstre af embryonale motoriske neuroner i Drosophila . De beskrevne protokoller omfatter, hvordan man dissekerer faste embryoner farvet med 1D4 aNtibody og forarbejdet i 3,3'-diaminobenzidin (DAB) til fileterede præparater. En kritisk fordel ved de flade præparater af faste embryoner er den bedre visualisering af de aksonale fremspring og muskelmønstre i periferien. Desuden viser dette arbejde også, hvordan man genotype faste embryoner for at sortere de ønskede mutantembryoner ved hjælp af LacZ-farvningsmetoden.

Protocol

1. Fremstilling Der fremstilles 500 ml phosphatpufret saltopløsning (PBS) med t-octylphenoxypolyethoxyethanol (PBT) opløsning ved at tilsætte 0,5 ml bovint serumalbumin (BSA) og 0,5 ml t-octylphenoxypolyethoxyethanol (se Materialetabellen) til 500 ml 1X PBS Og omrøring i mindst 30 minutter. Opbevares ved 4 ° C. Anvendes, når det er relativt frisk, og opbevares opløsningen i en ren flaske. Der fremstilles 10 ml 4% paraformaldehyd ved tilsætning af 2,5 ml 16% stock paraformaldehydopløsning og…

Representative Results

Præcise forbindelser mellem motorakser og målmuskler under neurale udvikling afhænger af selektiv axonaxonafstødning og målgennemgang ved bestemte valgpunkter 4 . I Drosophila reguleres selektiv afstødning mellem motoraxoner dels af den kombinerede virkning af klasse 1 og 2 semaforiner (Semas), herunder Sema-1a, Sema-2a og Sema-2b 8 , 14 , 15 , <…

Discussion

Detaljerne om motoriske aksonstyringsfejl scannes hurtigere og med bedre nøjagtighed ved det fileterede præparat af DAB-farvede embryoner end ved laserskanning af konfokal mikroskopi af fluorescensmærkede. Derfor er det fileterede præparat af faste og 1D4-farvede embryoner bedst egnet til den funktionelle karakterisering af vejledende kølemolekyler. Fire hovedklasser af vejledende signaler, herunder netrins, Slits, semaforer (Semas) og ephrins og deres kognitive receptorer har evolutionært bevaret roller på tvær…

Materials

Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
16% Paraformaldehyde Solution	Ted Pella	18505
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5405
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	30435
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	71500
X-Gal Substrate	US Biological	X1000	X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside)
Dimethyl Sulfxide	Sigma-Aldrich	D4540
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	Sigma-Aldrich	P9387
Potassium hexacyanoferrate(III)	Sigma-Aldrich	244023
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich	216763
3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride	Sigma-Aldrich	D5905
Agar	US Biological	A0930
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3
Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate)	Sigma-Aldrich	H5501
Culture Dish (60 mm)	Corning	430166
Tricon Beaker	Simport	B700-100	This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection.
Yeast	Societe Industrielle Lesaffre	Saf Instant Yeast Red
Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100)	VWR	14220-263
Eppendorf Tube (1.5 ml)	Sarstedt	#72.690
Bleach	The Clorox Company	Clorox
Heptane	Sigma-Aldrich	246654
Methanol	J.T. Baker	UN1230
Normal Goat Serum	Life Technologies	16210-064
Anti-FasciculinII Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	1D4 anti-Fasciclin II
Goat Anti-mouse-HRP Antibody	Jackson Immunoresearch	115-006-068	AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Slide Glass	Duran Group	235501403
Coverslip	Duran Group	235503104	18 x 18 mm
1 ml Syringe	Becton Dickinson Medical(s)	301321
Tungsten Needle	Ted Pella	#27-11	Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.)
Nutator (Mini twister)	Korean Science	KO.VS-96TWS	Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125)