Visualisierung des axonalen Projektionsmusters der embryonalen motorischen Neuronen in<em> Drosophila</em

Summary

Diese Arbeit beschreibt eine Standard-Immunhistochemie-Methode zur Visualisierung von Motor-Neuronen-Projektionen von späten Stadium-16 Drosophila Melanogaster Embryonen . Die gefilterte Präparation von festen Embryonen, die mit FasII-Antikörper gefärbt wurden, bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Gene zu charakterisieren, die für die motorische Axon-Pathfindung und die Zielerkennung während der neuronalen Entwicklung erforderlich sind.

Abstract

Die Etablierung funktioneller neuromuskulärer Schaltkreise beruht auf präzisen Verbindungen zwischen der Entwicklung von Motoraxonen und Zielmuskeln. Motorneuronen erweitern die Wachstumskegel, um auf bestimmten Wegen zu navigieren, indem sie auf eine große Anzahl von Axon-Guidance-Cues reagieren, die von der umgebenden extrazellulären Umgebung ausgehen. Die Wachstumskegel-Ziel-Erkennung spielt auch eine entscheidende Rolle bei der neuromuskulären Spezifität. Diese Arbeit stellt ein Standard-Immunhistochemie-Protokoll dar, um motorische Neuronprojektionen von späten Stadium-16 Drosophila melanogaster Embryonen zu visualisieren . Dieses Protokoll enthält einige wichtige Schritte, einschließlich eines Genotypisierungsverfahrens, um die gewünschten mutanten Embryonen zu sortieren; Ein Immunfärbeverfahren, um Embryonen mit Fasciclin II (FasII) Antikörper zu markieren; Und ein Dissektionsverfahren, um gefilterte Präparate aus festen Embryonen zu erzeugen. Motor-Axon-Projektionen und Muskelmuster in der Peripherie sind viel besser in flachen Präparationen von filtrierten Embryonen sichtbar als in whOle-Mount Embryonen Daher bietet die gefilterte Präparation von festen Embryonen, die mit FasII-Antikörper gefärbt sind, ein mächtiges Werkzeug, um die Gene zu charakterisieren, die für die motorische Axon-Pfadfindung und die Zielerkennung erforderlich sind, und sie können auch sowohl auf die Funktionsstörungen als auch auf die Funktionsgenauigkeits-Gattungsbildschirme angewendet werden .

Introduction

Präzise und selektive Verbindungen zwischen motorischen Axonen und Zielmuskeln während der embryonalen Entwicklung sind für die normale Fortbewegung in Drosophila- Larven essentiell . Die embryonale Strukturierung von 30 Muskelfasern in jedem der Bauchhöhenselemente A2-A7 wird nach Stufe 16 ¹ hergestellt. Die 36 motorischen Neuronen, die im ventralen Nervenkabel erzeugt werden, verlängern ihre Axone in die Peripherie, um spezifische Zielmuskeln zu innervieren ² . Die motorische Axonpfadfindung und die Zielerkennung können durch Immunhistochemie mit einem Antikörper (Mausmonoklonaler Antikörper 1D4) ^{3 , 4} sichtbar gemacht werden. Mehrere Bilder der motorischen Axonprojektionsmuster in Wildtyp Embryonen sind auf der Bahn ⁵ verfügbar. Der 1D4-Antikörper markiert alle motorischen Axone und drei Längsaxon-Faszikel auf jeder Seite der Mittellinie des embryonalen Zentralnervensystems (ZNS) ⁴ </sUp> ^{, 6} ( Abbildung 1C und Abbildung 2A ). Daher bietet die Immunhistochemie mit FasII-Antikörper ein leistungsfähiges Werkzeug zur Identifizierung von Genen, die für die neuromuskuläre Konnektivität erforderlich sind, um die molekularen Mechanismen zu demonstrieren, die der motorischen Axon-Anleitung und der Zielerkennung zugrunde liegen.

In jedem der Bauchhöhenselemente A2-A7 projizieren motorische Axone und selektiv in zwei Hauptnervenzweige, den Segmentnerv (SN) und den intersegmentalen Nerv (ISN) ^{2 , 4} und einen kleinen Nervenzweig, den Quernerv (TN ) ⁷ . Die SN selektiv defasciculiert, um zwei Nervenzweige zu nennen, die SNa und SNc genannt werden, während die ISN in drei Nervenzweige, die so genannten ISN, ISNb und ISNd ^{2 , 4} , aufgeteilt werden. Unter ihnen, ISN, ISNb und SNa MotoraxonDie Projektionsmuster werden am genauesten sichtbar gemacht, wenn Spitzstadium-16-Embryos mit FasII-Antikörper gefärbt werden und filtriert werden (Abbildung 1C und Abbildung 2A ). Die ISN-Motorneuronen verlängern ihre Axone, um die Dorsalmuskeln 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 und 20 ^{2 , 4} zu innervieren ( Fig. 2A ). Die ISNb-Motorneuronen innervieren die ventrolateralen Muskeln 6, 7, 12, 13, 14, 28 und 30 ^{2 , 4} ( 2A und 2B). Der SNa-Nerven-Zweig projiziert, um die Seitenmuskeln 5, 8, 21, 22, 23 und 24 ^{2 , 4} zu innervieren ( Fig. 2A ). Die TN, die aus zwei motorischen Axonen besteht, projiziert ipsilateral entlang der segmentalen Grenze, um den Muskel 25 zu innervieren und macht Synapsen mit dem lateralen bipolaren dendritischen Neuron (LBD) in derPeripherie ⁷ (Abbildung 2A ). Diese Zielmuskelinnervationen erfordern nicht nur die selektive Defaskik von motorischen Axonen an bestimmten Wahlpunkten, sondern auch die Zielmuskelerkennung. Darüber hinaus wurden einige mutmaßliche mesodermale Guidepost-Zellen, die als Zwischenziele fungieren, sowohl in den ISN- als auch in den SNa-Wegen gefunden, aber nicht entlang des ISNb-Weges ⁴ . Dies könnte darauf hindeuten, dass die ISNb-Motor-Axon-Pfadfindung im Vergleich zu der ISN- und SNa-Motor-Axon-Führung in einer bestimmten Weise reguliert werden kann, und es zeigt auch an, dass die periphere Motor-Axon-Führung ein attraktives experimentelles Modell bietet, um die Differential- oder konservierten Rollen eines einzelnen Leitfadens zu untersuchen Molekül ⁸

Diese Arbeit stellt eine Standardmethode dar, um die axonalen Projektionsmuster der embryonalen motorischen Neuronen in Drosophila zu visualisieren . Die beschriebenen Protokolle beinhalten, wie man feste Embryonen, die mit 1D4 a gefärbt sind, seziertNtibody und verarbeitet in 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) für filtrierte Zubereitungen. Ein kritischer Vorteil der flachen Präparate von festen Embryonen ist die bessere Visualisierung der axonalen Projektionen und Muskelmuster in der Peripherie. Darüber hinaus zeigt diese Arbeit auch, wie man feste Embryonen genotypisiert, um die gewünschten mutanten Embryos nach der LacZ-Färbemethode zu sortieren.

Protocol

1. Vorbereitung Vorbereitung von 500 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (PBT) -Lösung durch Zugabe von 0,5 g Rinderserumalbumin (BSA) und 0,5 ml t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (siehe Tabelle der Materialien) auf 500 ml 1X PBS Und Rühren für mindestens 30 min. Bei 4 ° C aufbewahren. Verwenden Sie, wenn relativ frisch und speichern Sie die Lösung in einer sauberen Flasche. Mischen Sie 10 ml 4% Paraformaldehyd durch Zugabe von 2,5 ml einer 16% igen St…

Representative Results

Präzise Verbindungen zwischen motorischen Axonen und Zielmuskeln während der neuronalen Entwicklung hängen von der selektiven Axonaxonabstoßung und der Zielerkennung an bestimmten Wahlpunkten ab 4 . In Drosophila wird die selektive Abstoßung zwischen motorischen Axonen teilweise durch die kombinierte Wirkung von Klasse 1 und 2 Semaphorinen (Semas), einschließlich Sema-1a, Sema-2a und Sema-2b 8 , 1…

Discussion

Die Details der Motor-Axon-Führungsdefekte werden durch die gefilterte Vorbereitung von DAB-gefärbten Embryonen schneller und mit besserer Genauigkeit erzielt als durch eine konfokale Mikroskopie von fluoreszenzmarkierten Laserscanning. Daher eignet sich die filtrierte Präparation von fixierten und 1D4-gefärbten Embryonen am besten für die funktionelle Charakterisierung von Guidance Cue Molekülen. Vier Hauptklassen von Leitlinien, darunter Netrine, Schlitze, Semaphorine (Semas) und Ephrine, und ihre verwandten Rez…

Materials

Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
16% Paraformaldehyde Solution	Ted Pella	18505
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5405
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	30435
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	71500
X-Gal Substrate	US Biological	X1000	X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside)
Dimethyl Sulfxide	Sigma-Aldrich	D4540
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	Sigma-Aldrich	P9387
Potassium hexacyanoferrate(III)	Sigma-Aldrich	244023
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich	216763
3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride	Sigma-Aldrich	D5905
Agar	US Biological	A0930
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3
Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate)	Sigma-Aldrich	H5501
Culture Dish (60 mm)	Corning	430166
Tricon Beaker	Simport	B700-100	This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection.
Yeast	Societe Industrielle Lesaffre	Saf Instant Yeast Red
Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100)	VWR	14220-263
Eppendorf Tube (1.5 ml)	Sarstedt	#72.690
Bleach	The Clorox Company	Clorox
Heptane	Sigma-Aldrich	246654
Methanol	J.T. Baker	UN1230
Normal Goat Serum	Life Technologies	16210-064
Anti-FasciculinII Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	1D4 anti-Fasciclin II
Goat Anti-mouse-HRP Antibody	Jackson Immunoresearch	115-006-068	AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Slide Glass	Duran Group	235501403
Coverslip	Duran Group	235503104	18 x 18 mm
1 ml Syringe	Becton Dickinson Medical(s)	301321
Tungsten Needle	Ted Pella	#27-11	Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.)
Nutator (Mini twister)	Korean Science	KO.VS-96TWS	Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125)