भ्रूण मोटर न्यूरॉन्स के एक्सोनल प्रोजेक्शन पैटर्न का विज़ुअलाइज़ेशन<em> ड्रोसोफिला</em
Summary
यह कार्य देर से चरण -16 ड्रोसोफिला मेलेनोगास्टर भ्रूण के मोटर न्यूरॉन अनुमानों को देखने के लिए एक मानक इम्यूनोहिस्टोकेमस्ट्री विधि का विवरण देता है। फासीआई एंटीबॉडी के साथ दागित निश्चित भ्रूणों की तैयार की गई तैयारी मरीज के लिए आवश्यक जीन को चिह्नित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है, जो तंत्रिका विकास के दौरान मोटर अक्षतंतु के पथपथिंग और लक्ष्य मान्यता के लिए आवश्यक है।
Abstract
कार्यात्मक neuromuscular सर्किट की स्थापना मोटर axons और लक्ष्य मांसपेशियों के विकास के बीच सटीक कनेक्शन पर निर्भर करता है। मोटर न्यूरॉन्स, बड़े पैमाने पर एपोन मार्गदर्शन संकेतों का जवाब देकर विशिष्ट मार्गों के साथ नेविगेट करने के लिए विकास शंकुओं का विस्तार करते हैं जो आसपास के बाह्य वातावरण से निकलते हैं। विकास शंकु लक्ष्य मान्यता स्नायविक विशेषताओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। यह काम देर से चरण -16 ड्रोसोफिला मेलेनोगास्टर भ्रूण के मोटर न्यूरॉन अनुमानों को देखने के लिए एक मानक इम्यूनोहिस्टोकेमेट्री प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। वांछित उत्परिवर्ती भ्रूण को क्रमबद्ध करने के लिए, इस प्रोटोकॉल में कुछ प्रमुख कदम शामिल हैं, जिसमें जीनोटाइपिंग प्रक्रिया भी शामिल है; एक फैमिलीलिन II (फासीआई) एंटीबॉडी के साथ भ्रूण को टैग करने के लिए, एक immunostaining प्रक्रिया; और एक विच्छेदन प्रक्रिया, निर्धारित भ्रूण से filleted तैयारी उत्पन्न करने के लिए। परिधि में मोटर अक्षतंतु के अनुमानों और मांसपेशियों के पैटर्न में फ़ैलते हुए भ्रूण के फ्लैट की तैयारी में बहुत बेहतर कल्पना की जाती हैऑल-माउंट भ्रूण इसलिए, FasII एंटीबॉडी के साथ दाग वाले निश्चित भ्रूणों की तैयार की गई तैयारी मोटर एक्सॉन पथफंडिंग और लक्ष्य मान्यता के लिए आवश्यक जीन को चिह्नित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है, और यह दोनों के नुकसान-के-फ़ंक्शन और फ़ंक्शन आनुवंशिक स्क्रीन के लिए भी लागू किया जा सकता है ।
Introduction
ड्रोसोफिला लार्वा में सामान्य गतिरोध के लिए भ्रूण के विकास के दौरान मोटर एक्सॉन और लक्ष्य की मांसपेशियों के बीच सटीक और चयनात्मक कनेक्शन आवश्यक हैं। ए 2-ए 7 के प्रत्येक पेट के गोलाकारों में 30 मांसपेशियों के फाइबर के भ्रूण पैटर्न को चरण 16 1 द्वारा स्थापित किया गया है। वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड में उत्पन्न 36 मोटर न्यूरॉन्स विशिष्ट लक्ष्य की मांसपेशियों को आवेशित करने के लिए परिधि में अपने एक्सॉन का विस्तार करते हैं। मोटर एक्सॉन पाथफाइंडिंग और लक्ष्य मान्यता को एंटीबॉडी (माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 1 डी 4 ) 3 , 4 के साथ प्रतिरक्षाविज्ञान द्वारा देखे जा सकते हैं। Wildtype भ्रूण में मोटर एक्सॉन प्रक्षेपण पैटर्न की कई छवियां वेब 5 पर उपलब्ध हैं । 1 डी 4 एंटीबॉडी भ्रूण केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के मध्य रेखा के प्रत्येक हिस्से पर सभी मोटर अक्षों और तीन अनुदैर्ध्य axon fascicles लेबल करता है </sअप> , 6 ( चित्रा -1 सी और चित्रा 2 ए )। इसलिए, FasII एंटीबॉडी के साथ इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री, मोटर एफ़ोनन मार्गदर्शन और लक्ष्य मान्यता वाले आणविक तंत्र का प्रदर्शन करने के लिए न्यूरोस्कुल्युलर कनेक्टिविटी के लिए आवश्यक जीन की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है।
प्रत्येक पेट में हेमिसिडेज ए 2-ए 7, मोटर एक्सॉन्स प्रोजेक्ट और दो प्रमुख तंत्रिका शाखाओं, कंबल तंत्रिका (एसएन) और अंतर्सैक्षीय तंत्रिका (आईएसएन) 2 , 4 , और एक छोटी सी तंत्रिका शाखा, अनुक्रम तंत्रिका (टीएन ) 7 एसएन चुनिंदा एसएनए और एसएनसी नामक दो तंत्रिका शाखाओं को जन्म देने के लिए डिस्फेक्टिबल बनाता है, जबकि आईएसएन आईएसएन, आईएसएनबी और आईएसएनडी 2 , 4 नामक तीन तंत्रिका शाखाओं में विभाजित है। उनमें से, आईएसएन, आईएसएनबी, और एसएनए मोटर एक्सॉनप्रक्षेपण पैटर्न सबसे सटीक रूप से देखा जाता है जब देर से चरण -16 भ्रूण FasII एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं और उन्हें चित्रित किया गया है ( चित्रा 1 सी और चित्रा 2 ए )। आईएसएन मोटर न्यूरॉन्स पृष्ठीय मांसपेशियों 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 1 9, और 20 2 , 4 ( चित्रा 2 ए ) में सांत्वना करने के लिए अपने कुल्हाड़ियों का विस्तार करते हैं। आईएसएनबी मोटर न्यूरॉन्स 6, 7, 12, 13, 14, 28, और 30 2 , 4 ( चित्रा 2 ए और 2 बी) के निचले हिस्से में दांतों की खुराक पेश करते हैं। एसएनए तंत्रिका शाखाएं पाल की मांसपेशियों 5, 8, 21, 22, 23 और 24 2 , 4 ( चित्रा 2 ए ) में प्रवेश करने के लिए प्रोजेक्ट करती हैं। तमिलनाडु, जिसमें दो मोटर अक्षांश होते हैं, स्तरीय सीमा के साथ-साथ मांसपेशियों को आवेशित करने के लिए प्रोजेक्ट को दो भागों में बांधा जाता है और पार्श्व द्विध्रुवी वृक्ष के समान न्यूरॉन (एलबीडी) के साथ शल्यक्रिया करता है।परिधि 7 ( चित्रा 2 ए ) इन लक्ष्यित मांसपेशियों में रहने की जगहों की आवश्यकता न केवल विशिष्ट पसंद बिंदुओं पर मोटर अक्षरों के डिफ़ैक्ज्यूलेशन का कारण है, बल्कि मांसपेशियों की पहचान को भी लक्षित करता है। इसके अलावा, आईएसएन और एसएनए दोनों रास्तेों में इंटरमीडिएट लक्ष्य के रूप में कार्य करने वाले कुछ ख्यातन मेसोडर्मल गाइडपोस्ट कोशिका पाए गए हैं, लेकिन आईएसएनबी मार्ग 4 के साथ नहीं। यह सुझाव दे सकता है कि आईएसएनबी मोटर एक्सॉन पथफंडिंग को आईएसएन और एसएनए मोटर एक्सॉन मार्गदर्शन की तुलना में एक अलग तरीके से विनियमित किया जा सकता है, और यह भी इंगित करता है कि परिधीय मोटर अक्ष मार्गदर्शन एक एकल मार्गदर्शन क्यूई के विभेदक या संरक्षित भूमिकाओं का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक प्रायोगिक मॉडल प्रदान करता है अणु 8
ड्रोसोफिला में भ्रूण मोटर न्यूरॉन्स के अक्षीय प्रक्षेपण पैटर्न की कल्पना करने के लिए यह काम एक मानक विधि प्रस्तुत करता है। वर्णित प्रोटोकॉल में 1 डी 4 ए के साथ दाग वाले निश्चित भ्रूण को कैसे छेड़ना हैNtibody और तैयार की गई तैयारी के लिए 3,3'-हिरिनोबेंज़ाइडिन (डीएबी) में संसाधित। निश्चित भ्रूण की सपाट तैयारियों का एक महत्वपूर्ण लाभ परिधि में axonal अनुमानों और मांसपेशियों के पैटर्न का बेहतर दृश्य है। इसके अलावा, यह काम यह भी दिखाता है कि एलएसीजेड धुंधला विधि का उपयोग करने वाले वांछित उत्परिवर्ती भ्रूण को क्रमबद्ध करने के लिए निर्धारित भ्रूण को कैसे जीनोटाइप किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
मोटर एक्सॉन मार्गदर्शन दोषों का ब्योरा तेजी से और दाब-दागयुक्त भ्रूण की तैयार की गई तैयारी से बेहतर सटीकता के साथ लेजर स्कैनिंग की तुलना में फ्लोरोसेंटली लेबल वाले लोगों की कन्फोकल माइक्रोस्कोपी की ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
मैं एलेक्स एल। कोलोडकीन का शुक्रिया अदा करता हूं, जैसा कि मैंने अपनी प्रयोगशाला में यह चित्रित तैयारी प्रोटोकॉल सीखा है। तकनीकी सहायता के लिए मैं यंग जी हाँग का भी धन्यवाद करता हूं। यह अध्ययन एनआरएफ-2013 आर 1 ए 1 ए 4 ए 101011329 (एसजे) द्वारा समर्थित था।
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Ted Pella | 18505 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | 71500 | |
| X-Gal Substrate | US Biological | X1000 | X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside) |
| Dimethyl Sulfxide | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma-Aldrich | 244023 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| 3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| Agar | US Biological | A0930 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate) | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Culture Dish (60 mm) | Corning | 430166 | |
| Tricon Beaker | Simport | B700-100 | This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection. |
| Yeast | Societe Industrielle Lesaffre | Saf Instant Yeast Red | |
| Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100) | VWR | 14220-263 | |
| Eppendorf Tube (1.5 ml) | Sarstedt | #72.690 | |
| Bleach | The Clorox Company | Clorox | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | 246654 | |
| Methanol | J.T. Baker | UN1230 | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Anti-FasciculinII Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4 anti-Fasciclin II | |
| Goat Anti-mouse-HRP Antibody | Jackson Immunoresearch | 115-006-068 | AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Slide Glass | Duran Group | 235501403 | |
| Coverslip | Duran Group | 235503104 | 18 x 18 mm |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson Medical(s) | 301321 | |
| Tungsten Needle | Ted Pella | #27-11 | Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.) |
| Nutator (Mini twister) | Korean Science | KO.VS-96TWS | Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125) |
References
- Bate, M. The embryonic development of larval muscles in Drosophila. Development. 110 (3), 791-804 (1990).
- Landgraf, M., Thor, S. Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology. Semin. Cell Dev. Biol. 17 (1), 3-11 (2006).
- Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67 (1), 45-57 (1991).
- Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. Cell. 73 (6), 1137-1153 (1993).
- . Available from: https://www.its.caltech.edu/~zinnlab/motoraxons.html (2017)
- Seeger, M., Tear, G., Ferres-Marco, D., Goodman, C. S. Mutations affecting growth cone guidance in Drosophila: genes necessary for guidance toward or away from the midline. Neuron. 10 (3), 409-426 (1993).
- Thor, S., Thomas, J. B. The Drosophila islet gene governs axon pathfinding and neurotransmitter identity. Neuron. 18 (3), 397-409 (1997).
- Roh, S., Yang, D. S., Jeong, S. Differential ligand regulation of PlexB signaling in motor neuron axon guidance in Drosophila. Int. J. Dev. Neurosci. 55, 34-40 (2016).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).
- Patel, N. H., Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods in cell biology, vol 44. Drosophila melanogaster: practical uses in cell biology. 44, 445-487 (1994).
- Lee, H. K., Wright, A. P., Zinn, K. Live dissection of Drosophila embryos: streamlined methods for screening mutant collections by antibody staining. J. Vis. Exp. (34), (2009).
- Hartenstein, V. Stages of Embryonic Development. Atlas of Drosophila. development. , 52 (1993).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull. World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
- Kolodkin, A. L. Fasciclin IV: sequence, expression, and function during growth cone guidance in the grasshopper embryo. Neuron. 9 (5), 831-845 (1992).
- Jeong, S., Juhaszova, K., Kolodkin, A. L. The Control of semaphorin-1a-mediated reverse signaling by opposing pebble and RhoGAPp190 functions in Drosophila. Neuron. 76 (4), 721-734 (2012).
- Winberg, M. L. Plexin A is a neuronal semaphorin receptor that controls axon guidance. Cell. 95 (7), 903-916 (1998).
- Yang, D. S., Roh, S., Jeong, S. The axon guidance function of Rap1 small GTPase is independent of PlexA RasGAP activity in Drosophila. Dev. Biol. 418 (2), 258-267 (2016).
- Yu, H. H., Araj, H. H., Ralls, S. A., Kolodkin, A. L. The transmembrane Semaphorin Sema I is required in Drosophila for embryonic motor and CNS axon guidance. Neuron. 20 (2), 207-220 (1998).
- Hartenstein, V. Stages of Embryonic Development. Atlas of Drosophila. development. , 52 (1993).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Kidd, T. Roundabout controls axon crossing of the CNS midline and defines a novel subfamily of evolutionarily conserved guidance receptors. Cell. 92 (2), 205-215 (1998).
- Pasterkamp, R. J. Getting neural circuits into shape with semaphorins. Nat. Rev. Neurosci. 13 (9), 605-618 (2012).
