Визуализация шаблона аксонной проекции эмбриональных моторных нейронов в<em> Drosophila</em
Summary
В этой работе подробно описан метод иммуногистохимии для визуализации проекций моторных нейронов эмбрионов Drosophila melanogaster поздней стадии 16. Филеарный препарат фиксированных эмбрионов, окрашенных антителом FasII, представляет собой мощный инструмент для характеристики генов, необходимых для отслеживания моторного аксона и распознавания мишеней при развитии нервной системы.
Abstract
Установление функциональных нервно-мышечных схем основано на точном соединении между развивающимися двигательными аксонами и мышцами мишени. Моторные нейроны расширяют конусы роста, чтобы перемещаться по определенным путям, реагируя на большое количество сигналов аксонов, которые исходят из окружающей внеклеточной среды. Признание цели конуса роста также играет критическую роль в нервно-мышечной специфичности. В этой работе представлен стандартный протокол иммуногистохимии для визуализации прогнозов моторных нейронов эмбрионов Drosophila melanogaster поздней стадии 16. Этот протокол включает в себя несколько ключевых шагов, включая процедуру генотипирования, для сортировки желаемых мутантных эмбрионов; Иммуноокрашивание, для маркировки эмбрионов с антителом fasciclin II (FasII); И процедуру вскрытия, для получения филе готовых препаратов из фиксированных эмбрионов. Прогнозы монокристалла и мышечные структуры на периферии гораздо лучше визуализируются в плоских препаратах филе эмбрионов, чем в whOle-mount эмбрионов. Таким образом, филеобразный препарат фиксированных эмбрионов, окрашенных антителом FasII, является мощным инструментом для характеристики генов, необходимых для отслеживания траектории моторного аксона и распознавания мишеней, а также может быть применен как к генетическим экранам с потерей функции, так и к генетическим характеристикам ,
Introduction
Точные и селективные связи между аксонами мотора и мышцами мишени во время эмбрионального развития необходимы для нормальной локомоции у личинок дрозофилы . Эпизодическое моделирование 30 мышечных волокон в каждом из абдоминальных полушарий A2-A7 устанавливается на этапе 16 1 . 36 двигательных нейронов, которые генерируются в брюшном нервном шнуре, расширяют свои аксоны на периферию, чтобы иннервировать определенные мышцы мишени 2 . Обнаружение пути мокрого аксона и распознавание мишени можно визуализировать с помощью иммуногистохимии с помощью антитела (мышиного моноклонального антитела 1D4) 3 , 4 . В Интернете доступно несколько изображений моделей проекции аксонных моторов у эмбрионов дикого типа 5 . 1D4-антитело обозначает все моторные аксоны и три продольных аксонных пучка на каждой стороне средней линии эмбриональной центральной нервной системы (ЦНС) 4 </sВверх> , 6 ( рис. 1С и рис. 2А ). Поэтому иммуногистохимия с антителом FasII обеспечивает мощный инструмент для идентификации генов, необходимых для нейромышечной связи, для демонстрации молекулярных механизмов, лежащих в основе руководства аксоном двигателя и распознавания цели.
В каждом из абдоминальных гемосегментов A2-A7 двигательные аксоны проектируются и выборочно пущены в две главные нервные ветви, сегментный нерв (SN) и межсегментный нерв (ISN) 2 , 4 и небольшая нервная ветвь, поперечный нерв (TN ) 7 . SN выборочно обезвреживает образование двух нервных ветвей, называемых SNa и SNc, тогда как ISN разбивается на три нервные ветви, называемые ISN, ISNb и ISNd 2 , 4 . Среди них ISN, ISNb и SNa моторный аксонПроекции наиболее точно визуализируются, когда эмбрионы поздней стадии 16 окрашиваются антителом FasII и филе ( фиг. 1С и фиг. 2А ). Моторные нейроны ISN расширяют свои аксоны до иннервирования дорсальных мышц 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 и 20 2 , 4 ( фиг. 2A ). Моторные нейроны ISNb иннервируют вентролатеральные мускулы 6, 7, 12, 13, 14, 28 и 30 2 , 4 ( фиг. 2A и 2B). Отделение нервной системы SNa предназначено для иннервирования боковых мышц 5, 8, 21, 22, 23 и 24 2 , 4 ( рисунок 2A ). TN, состоящая из двух моторных аксонов, реализует ipsilaterally вдоль сегментарной границы до иннервирующей мышцы 25 и делает синапсы с боковым биполярным дендритным нейроном (LBD) вПериферия 7 ( рисунок 2A ). Эти целевые мышечные иннервации требуют не только выборочной деасцикуляции моторных аксонов в определенных точках выбора, но и распознавания мишеней мышц. Кроме того, некоторые предполагаемые клетки мезодермального ориентира, которые выступают в качестве промежуточных целей, были обнаружены как в пути ISN, так и SNa, но не по пути ISNb 4 . Это может указывать на то, что отслеживание пути аксонов двигателя ISNb может быть отрегулировано в явном виде по сравнению с руководством по аксону с двигателем ISN и SNa, а также указывает на то, что руководство по аксону в периферийном двигателе обеспечивает привлекательную экспериментальную модель для изучения дифференциальных или консервативных ролей одного указательного указателя Молекула 8 .
Эта работа представляет собой стандартный метод визуализации аксонных проекционных рисунков эмбриональных моторных нейронов у Drosophila . Описанные протоколы включают в себя как рассекать фиксированные эмбрионы, окрашенные 1D4 aИ обрабатывали в 3,3'-диаминобензидине (DAB) для филе готовых препаратов. Одним из важных преимуществ плоских препаратов фиксированных эмбрионов является лучшая визуализация аксонных выступов и мышечных структур на периферии. Кроме того, эта работа также показывает, как генотипировать фиксированные эмбрионы для сортировки желаемых мутантных эмбрионов с использованием метода окрашивания LacZ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Детали дефектов наведения аксонов двигателя оцениваются быстрее и с большей точностью путем филеарного приготовления эмбрионов, окрашенных DAB, чем лазерная сканирующая конфокальная микроскопия флуоресцентно меченных. Таким образом, филеобразный препарат фиксированных и 1D4-окрашенн…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Я благодарю Алексея Колодкина, так как я узнал этот протокол филе подготовки в своей лаборатории. Я также благодарю Young Gi Hong за техническую помощь. Это исследование было поддержано NRF-2013R1A1A4A01011329 (SJ).
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Ted Pella | 18505 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | 71500 | |
| X-Gal Substrate | US Biological | X1000 | X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside) |
| Dimethyl Sulfxide | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma-Aldrich | 244023 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| 3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| Agar | US Biological | A0930 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate) | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Culture Dish (60 mm) | Corning | 430166 | |
| Tricon Beaker | Simport | B700-100 | This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection. |
| Yeast | Societe Industrielle Lesaffre | Saf Instant Yeast Red | |
| Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100) | VWR | 14220-263 | |
| Eppendorf Tube (1.5 ml) | Sarstedt | #72.690 | |
| Bleach | The Clorox Company | Clorox | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | 246654 | |
| Methanol | J.T. Baker | UN1230 | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Anti-FasciculinII Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4 anti-Fasciclin II | |
| Goat Anti-mouse-HRP Antibody | Jackson Immunoresearch | 115-006-068 | AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Slide Glass | Duran Group | 235501403 | |
| Coverslip | Duran Group | 235503104 | 18 x 18 mm |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson Medical(s) | 301321 | |
| Tungsten Needle | Ted Pella | #27-11 | Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.) |
| Nutator (Mini twister) | Korean Science | KO.VS-96TWS | Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125) |
References
- Bate, M. The embryonic development of larval muscles in Drosophila. Development. 110 (3), 791-804 (1990).
- Landgraf, M., Thor, S. Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology. Semin. Cell Dev. Biol. 17 (1), 3-11 (2006).
- Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67 (1), 45-57 (1991).
- Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. Cell. 73 (6), 1137-1153 (1993).
- . Available from: https://www.its.caltech.edu/~zinnlab/motoraxons.html (2017)
- Seeger, M., Tear, G., Ferres-Marco, D., Goodman, C. S. Mutations affecting growth cone guidance in Drosophila: genes necessary for guidance toward or away from the midline. Neuron. 10 (3), 409-426 (1993).
- Thor, S., Thomas, J. B. The Drosophila islet gene governs axon pathfinding and neurotransmitter identity. Neuron. 18 (3), 397-409 (1997).
- Roh, S., Yang, D. S., Jeong, S. Differential ligand regulation of PlexB signaling in motor neuron axon guidance in Drosophila. Int. J. Dev. Neurosci. 55, 34-40 (2016).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).
- Patel, N. H., Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods in cell biology, vol 44. Drosophila melanogaster: practical uses in cell biology. 44, 445-487 (1994).
- Lee, H. K., Wright, A. P., Zinn, K. Live dissection of Drosophila embryos: streamlined methods for screening mutant collections by antibody staining. J. Vis. Exp. (34), (2009).
- Hartenstein, V. Stages of Embryonic Development. Atlas of Drosophila. development. , 52 (1993).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull. World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
- Kolodkin, A. L. Fasciclin IV: sequence, expression, and function during growth cone guidance in the grasshopper embryo. Neuron. 9 (5), 831-845 (1992).
- Jeong, S., Juhaszova, K., Kolodkin, A. L. The Control of semaphorin-1a-mediated reverse signaling by opposing pebble and RhoGAPp190 functions in Drosophila. Neuron. 76 (4), 721-734 (2012).
- Winberg, M. L. Plexin A is a neuronal semaphorin receptor that controls axon guidance. Cell. 95 (7), 903-916 (1998).
- Yang, D. S., Roh, S., Jeong, S. The axon guidance function of Rap1 small GTPase is independent of PlexA RasGAP activity in Drosophila. Dev. Biol. 418 (2), 258-267 (2016).
- Yu, H. H., Araj, H. H., Ralls, S. A., Kolodkin, A. L. The transmembrane Semaphorin Sema I is required in Drosophila for embryonic motor and CNS axon guidance. Neuron. 20 (2), 207-220 (1998).
- Hartenstein, V. Stages of Embryonic Development. Atlas of Drosophila. development. , 52 (1993).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Kidd, T. Roundabout controls axon crossing of the CNS midline and defines a novel subfamily of evolutionarily conserved guidance receptors. Cell. 92 (2), 205-215 (1998).
- Pasterkamp, R. J. Getting neural circuits into shape with semaphorins. Nat. Rev. Neurosci. 13 (9), 605-618 (2012).
