Visualisering av Axonal Projektionsmönstret av Embryonic Motor Neurons in<em> Drosophila</em
Summary
Detta arbete beskriver en standard immunohistokemi metod för att visualisera motor neuron prognoser av sena stadium-16 Drosophila melanogaster embryon. Den fileterade beredningen av fasta embryon färgade med FasII-antikroppen tillhandahåller ett kraftfullt verktyg för att karakterisera de gener som krävs för motoraxonvägfinding och måligenkänning under neuralt utveckling.
Abstract
Inrättandet av funktionella neuromuskulära kretsar bygger på exakta kopplingar mellan utvecklande motoraxoner och målmuskler. Motorneuroner förlänger tillväxtkeglerna för att navigera längs specifika vägar genom att svara på ett stort antal axonvägledningsignaler som härrör från den omgivande extracellulära miljön. Målkännetecknet för tillväxtkegeln spelar också en kritisk roll i neuromuskulär specificitet. Detta arbete presenterar ett standard immunohistokemi protokoll för att visualisera motor neuronprojektioner av sena stadium-16 Drosophila melanogaster embryon. Detta protokoll innefattar några nyckelsteg, inklusive en genotypprocedur, för att sortera de önskade mutantembryonerna; Ett immunförfärande förfarande för att märka embryon med fasciclin II (FasII) antikropp; Och ett dissektionsförfarande för att generera fileterade preparat från fasta embryon. Motoraxonprojektioner och muskelmönster i periferin är mycket bättre visualiserade i platta preparat av fileterade embryon än i whOle-mount embryon. Därför ger den fileterade beredningen av fasta embryon färgade med FasII-antikroppen ett kraftfullt verktyg för att karakterisera de gener som krävs för motoraxonvägfindning och måligenkänning och det kan också appliceras både på funktionsfel och funktionskrävande genetiska skärmar .
Introduction
Exakta och selektiva kopplingar mellan motoraxon och målmuskler under embryonal utveckling är nödvändiga för normal framdrivning i Drosophila larver. Den embryonala mönstret av 30 muskelfibrer i var och en av bukhemisegmenten A2-A7 är etablerad genom steg 16 1 . De 36 motorneuronerna som genereras i ventralnervsbandet sträcker sig axonerna i periferin för att innervate specifika målmuskler 2 . Motoraxonvägfinding och måligenkänning kan visualiseras genom immunhistokemi med en antikropp (musmonoklonal antikropp 1D4) 3 , 4 . Flera bilder av motorns axonprojektionsmönster i vildtypsembryon finns på webben 5 . 1D4-antikroppen märker alla motoraxoner och tre longitudinella axonfasikaler på vardera sidan av mittlinjen i det embryonala centrala nervsystemet (CNS) 4 </sUpp> , 6 ( Figur 1C och Figur 2A ). Därför tillhandahåller immunhistokemi med FasII-antikropp ett kraftfullt verktyg för att identifiera gener som krävs för neuromuskulär anslutning för att demonstrera de molekylära mekanismer som ligger till grund för motoraxonvägledning och måligenkänning.
I var och en av bukhemisegmenten A2-A7 projekterar motoraxonsprojektet och selektivt fasciculeras i två huvudsakliga nervgrenar, segmentsnerven (SN) och den intersegmentella nerven (ISN) 2 , 4 och en mindre nervgren, den transversella nerven (TN ) 7 . SN definierar selektivt för att ge upphov till två nervgrenar som kallas SNa och SNc, medan ISN delas in i tre nervgrenar som heter ISN, ISNb och ISNd 2 , 4 . Bland dem är ISN, ISNb och SNA motoraxonProjiceringsmönstren visualiseras mest exakt när sent stadium 16 embryon färgas med FasII-antikropp och är fileterade ( Figur 1C och Figur 2A ). ISN-motorneuronerna förlänger sina axoner till innerliga dorsala musklerna 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 och 20 2 , 4 ( Figur 2A ). ISNb-motorneuronerna innervatar ventrolaterala muskler 6, 7, 12, 13, 14, 28 och 30 2 , 4 ( Figur 2A och 2B). SNa-nervgrenen projekterar att innerva laterala muskler 5, 8, 21, 22, 23 och 24 2 , 4 ( Figur 2A ). TN, som består av två motoraxoner, projicerar ipsilateralt längs segmentgränsen mot inre muskeln 25 och gör synapser med den laterala bipolära dendritiska neuronen (LBD) iPeriferin 7 ( figur 2A ). Dessa målmuskelinnervationer kräver inte bara selektiv defaskikulering av motoraxoner vid specifika valpunkter, utan också inriktning på muskeligenkänning. Dessutom finns vissa förmodade mesodermala styrpostceller som fungerar som mellanmål i både ISN och SNa-vägarna, men inte längs ISNb-vägen 4 . Detta kan antyda att ISNb-motoraxonvägsfinansiering kan regleras på ett distinkt sätt jämfört med ISN- och SNa-motoraxonvägledning och det indikerar också att perifermotoraxonvägledning ger en attraktiv experimentell modell för att studera skillnaden eller bevarade roller i en enda styrningsledning Molekyl 8
Detta arbete presenterar en standardmetod för att visualisera de axonala projiceringsmönstren hos embryonala neuroner i Drosophila . De beskrivna protokollen innefattar hur man dissekerar fasta embryon färgade med 1D4aNtibody och bearbetas i 3,3'-diaminobenzidin (DAB) för fileterade preparat. En kritisk fördel med de platta förberedelserna av fasta embryon är den bättre visualiseringen av axonala utsprång och muskelmönster i periferin. Vidare visar detta arbete hur man genotypar fasta embryon för att sortera de önskade mutantembryonerna med hjälp av LacZ-färgmetoden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detaljerna för motorisk axonstyrningsdefekter poängsätts snabbare och med bättre noggrannhet av den fileterade beredningen av DAB-färgade embryon än genom laserskanning av konfokal mikroskopi av fluorescensmärkta sådana. Därför passar den fileterade beredningen av fasta och 1D4-färgade embryon bäst för den funktionella karaktäriseringen av vägledningsmolekyler. Fyra huvudklasser av vägledningssignaler, inklusive netrins, Slits, semaforiner (Semas) och ephrins, och deras kognitiva receptorer har evolution…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jag tackar Alex L. Kolodkin, som jag lärde mig detta fileterade preparatprotokoll i sitt laboratorium. Jag tackar också Young Gi Hong för tekniskt bistånd. Denna studie stöddes av NRF-2013R1A1A4A01011329 (SJ).
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Ted Pella | 18505 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | 71500 | |
| X-Gal Substrate | US Biological | X1000 | X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside) |
| Dimethyl Sulfxide | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma-Aldrich | 244023 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| 3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| Agar | US Biological | A0930 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate) | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Culture Dish (60 mm) | Corning | 430166 | |
| Tricon Beaker | Simport | B700-100 | This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection. |
| Yeast | Societe Industrielle Lesaffre | Saf Instant Yeast Red | |
| Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100) | VWR | 14220-263 | |
| Eppendorf Tube (1.5 ml) | Sarstedt | #72.690 | |
| Bleach | The Clorox Company | Clorox | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | 246654 | |
| Methanol | J.T. Baker | UN1230 | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Anti-FasciculinII Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4 anti-Fasciclin II | |
| Goat Anti-mouse-HRP Antibody | Jackson Immunoresearch | 115-006-068 | AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Slide Glass | Duran Group | 235501403 | |
| Coverslip | Duran Group | 235503104 | 18 x 18 mm |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson Medical(s) | 301321 | |
| Tungsten Needle | Ted Pella | #27-11 | Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.) |
| Nutator (Mini twister) | Korean Science | KO.VS-96TWS | Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125) |
References
- Bate, M. The embryonic development of larval muscles in Drosophila. Development. 110 (3), 791-804 (1990).
- Landgraf, M., Thor, S. Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology. Semin. Cell Dev. Biol. 17 (1), 3-11 (2006).
- Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67 (1), 45-57 (1991).
- Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. Cell. 73 (6), 1137-1153 (1993).
- . Available from: https://www.its.caltech.edu/~zinnlab/motoraxons.html (2017)
- Seeger, M., Tear, G., Ferres-Marco, D., Goodman, C. S. Mutations affecting growth cone guidance in Drosophila: genes necessary for guidance toward or away from the midline. Neuron. 10 (3), 409-426 (1993).
- Thor, S., Thomas, J. B. The Drosophila islet gene governs axon pathfinding and neurotransmitter identity. Neuron. 18 (3), 397-409 (1997).
- Roh, S., Yang, D. S., Jeong, S. Differential ligand regulation of PlexB signaling in motor neuron axon guidance in Drosophila. Int. J. Dev. Neurosci. 55, 34-40 (2016).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).
- Patel, N. H., Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods in cell biology, vol 44. Drosophila melanogaster: practical uses in cell biology. 44, 445-487 (1994).
- Lee, H. K., Wright, A. P., Zinn, K. Live dissection of Drosophila embryos: streamlined methods for screening mutant collections by antibody staining. J. Vis. Exp. (34), (2009).
- Hartenstein, V. Stages of Embryonic Development. Atlas of Drosophila. development. , 52 (1993).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull. World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
- Kolodkin, A. L. Fasciclin IV: sequence, expression, and function during growth cone guidance in the grasshopper embryo. Neuron. 9 (5), 831-845 (1992).
- Jeong, S., Juhaszova, K., Kolodkin, A. L. The Control of semaphorin-1a-mediated reverse signaling by opposing pebble and RhoGAPp190 functions in Drosophila. Neuron. 76 (4), 721-734 (2012).
- Winberg, M. L. Plexin A is a neuronal semaphorin receptor that controls axon guidance. Cell. 95 (7), 903-916 (1998).
- Yang, D. S., Roh, S., Jeong, S. The axon guidance function of Rap1 small GTPase is independent of PlexA RasGAP activity in Drosophila. Dev. Biol. 418 (2), 258-267 (2016).
- Yu, H. H., Araj, H. H., Ralls, S. A., Kolodkin, A. L. The transmembrane Semaphorin Sema I is required in Drosophila for embryonic motor and CNS axon guidance. Neuron. 20 (2), 207-220 (1998).
- Hartenstein, V. Stages of Embryonic Development. Atlas of Drosophila. development. , 52 (1993).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Kidd, T. Roundabout controls axon crossing of the CNS midline and defines a novel subfamily of evolutionarily conserved guidance receptors. Cell. 92 (2), 205-215 (1998).
- Pasterkamp, R. J. Getting neural circuits into shape with semaphorins. Nat. Rev. Neurosci. 13 (9), 605-618 (2012).
