Leben-Zelle Messung der Geruchsstoff Rezeptor Aktivierung mit einem Echtzeit-cAMP-Assay
Summary
Charakterisierung der Funktion der Geruchsstoff Rezeptoren dient einen unverzichtbaren Bestandteil in der Deorphanization-Prozess. Wir beschreiben eine Methode zur Messung der Aktivierung des Duftstoff-Rezeptoren in Echtzeit über einen cAMP-Assay.
Abstract
Die enorme Größe der Säugetier-Geruchsstoff Rezeptor (OR) Familien Schwierigkeiten, ihre Verwandten Liganden unter zahlreichen flüchtigen Chemikalien zu finden. Um effizient und präzise ORs deorphanize, kombinieren wir die Verwendung einer heterologen Zelllinie Säugetier-ORs und ein genetisch veränderter Biosensor-Plasmid Lager Produktion flussabwärts von OR Aktivierung in Echtzeit zu messen zum Ausdruck bringen. Dieser Test kann auf Bildschirm Geruchsstoffe gegen ORs und umgekehrtverwendet werden. Duftstoff-Rezeptor-positiven Interaktionen von den Bildschirmen können anschließend durch Tests mit verschiedenen Konzentrationen von Geruch, Generierung von Konzentration-Wirkungs-Kurven bestätigt werden. Hier haben wir diese Methode durchführen eine Hochdurchsatz-Screening eine duftende Substanz gegen eine menschliche OR-Bibliothek in Hana3A Zellen exprimiert und bestätigt, dass der Rezeptor reagiert positiv cognate Rezeptor für die Verbindung von Interesse ist. Wir fanden diese Hochdurchsatz-Erkennungsmethode effizient und zuverlässig bei der Beurteilung der OR-Aktivierung und unsere Daten liefern ein Beispiel für den möglichen Einsatz in OR funktionelle Studien.
Introduction
Der Geruchssinn spielt eine wichtige Rolle in der Tiere überleben, da sie verlassen sich auf ihre olfaktorischen Fähigkeiten erhalten Nahrung, Raubtiere und Gefahr zu vermeiden, Arten zu unterscheiden, und wählen Mate1,2. Die Realisierung dieser Funktionen hängt von der Duftstoff-Rezeptoren (ORs), die individuell an die ciliary Oberfläche des olfaktorischen sensorischen Neuronen (Korrelationsmöglichkeiten) befindet sich in der olfaktorischen Epithel (OE) ausgedrückt werden. Regionen in äußerster Randlage bilden die größte Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR)-Superfamilie mit ungefähr 400 und 1200 verschiedene OR Gene im menschlichen und Maus, bzw.3,4,5. Regionen in äußerster Randlage aktiviert durch Geruchsstoffe führen zu erhöhten intrazellulären cAMP-Spiegel über die sequentielle Aktivierung des olfaktorischen G-Protein (GOlf) und Typ III Adenylyl Cyclase (ACIII). Die daraus resultierende erhöhte intrazelluläre cAMP könnte funktionieren als zweiter Bote, der Nucleotide-gated Kanal auf der Zelloberfläche öffnet, Auslösung Zustrom von kationen einschließlich Ca2 + und Aktionspotentiale, und letztlich zu initiieren Neuro-Potenzial Übertragungs- und olfaktorischen Wahrnehmung. Der Prozess der Erkennung und Unterscheidung eine große Anzahl von Riechstoffen von Regionen in äußerster Randlage gilt als der erste Schritt der olfaktorischen Wahrnehmung6,7.
Da Buck und Axel8 zuerst erfolgreich Geruchsstoff Rezeptoren geklont und den Mechanismus der olfaktorischen Wahrnehmung von Regionen in äußerster Randlage initiiert erläutert, wurde Deorphanization der OR-Familie einer der Hotspots in diesem Bereich. Verschiedenen in Vivo, Ex Vivo und in Vitro Methoden, OR Aktivierung zu messen gewesen gemeldeten9,10,11,12. Eine traditionelle Methode, Ca2 + Bildgebung von einzelligen RT-PCR auf Korrelationsmöglichkeiten gefolgt ermöglicht die Identifizierung der verschiedenen Regionen in äußerster Randlage aliphatischen Geruchsstoffe13,14,15. In jüngerer Zeit, das Aufkommen der großen Transkriptom-Analysen förderte die Entwicklung des mehr Hochdurchsatz- in-Vivo -Methoden. Der Kentucky-Test identifiziert Eugenol und Muscone-reagierende Maus ORs mit dem Einsatz der S100a5-TauGFP-Reporter Maus Belastung und Microarray Analyse9. Basierend auf den Rückgang der OR-mRNA-Niveaus nach Geruchsstoff Exposition, beschäftigt die Traum-Technologie ein transkriptomischen Konzept zur Bestimmung des OR Aktivierung Profile in beide Wirbeltiere und nicht-Wirbeltier-Arten-16. In ähnlicher Weise angesichts der Phosphorylierung des S6 in neuronalen Aktivierungen, die Matsunami Gruppe sequenzierten mRNAs aus phosphorylierten Ribosom Immunperoxidase, reaktionsschnelle ORs12zu identifizieren. Schließlich berichtet Feinstein Gruppe super Sniffer-Mäuse, die als Plattform, um Geruch Codierung in Vivo, bekannt als die MouSensor-Technologie-17Studie dienen könnten.
Im Bereich in-vitro- macht die Herausforderung der Kultivierung Korrelationsmöglichkeiten heterologen Expressionssystem, die imitiert, OR funktionelle Expression in Vivo eine ideale Lösung für große Screening von wohlriechenden Chemikalien für Regionen in äußerster Randlage führen. Jedoch da kultivierten Zelllinien nicht olfaktorische Herkunft unterscheiden sich von einheimischen Korrelationsmöglichkeiten oder Proteine werden in dem endoplasmatischen Retikulum und nicht in der Lage, um die Plasmamembran Verkehr beibehalten, was in OR Abbau und Verlust von Rezeptor-Funktion18 , 19. um dieses Problem zu lösen, umfangreiche Werke vorgenommen wurden, OR funktionelle Expression auf der Zellmembran in heterologen Zelllinien zu replizieren. Krautwurst Et Al. zuerst die ersten 20 Aminosäuren von Rhodopsin (Rho-Tag) an die N-terminale OR Protein und dies förderte die Zelloberfläche Ausdruck von einigen ORs in menschlichen embryonalen Niere (HEK) Zellen20. Durch eine serielle Analyse der Genanalyse Ausdruck (Salbei) Bibliothek aus einzelnen Korrelationsmöglichkeiten Saito Et Al. zuerst geklont, die Rezeptor-der Transport von Protein (RTP) Familienmitglieder, RTP1 und RTP2 und der Rezeptor Ausdruck Enhancer Protein 1 (REEP1), das or Menschenhandel an der Zellmembran erleichtert und verbessert Duftstoff-vermittelten Reaktionen der ORs in HEK293T Zellen 21. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen, Matsunami Gruppe erfolgreich etabliert die Hana3A-Zell-Linie mit RTP1 und RTP2, REEP1 sowie GαOlf in HEK293T stabil transfiziert und vorübergehend mit Rho-Tags ORs für effiziente oder funktionale transfiziert Ausdruck. Nachfolgende Studien zeigte (1) eine kürzere Form der RTP1, RTP1S, die stärker zu fördern oder funktionieren als das ursprüngliche RTP1 Protein und (2) der Typ 3 Muskarin Acetylcholin-Rezeptor (M3R), die OR-Aktivität über Hemmung der β-arrestin-2 verbessern könnte Rekrutierung, beide auf der heterologen Expressionssystem experimentelle Optimierung eingeführt wurden Ausgabe22,23.
Verschiedene Nachweismethoden wurden zur Aktivierung des Rezeptors in heterologen Systemen zu quantifizieren. Die sekretierten plazentare alkalische Phosphatase (SEAP) Assay arbeitet mit einem Reporter Enzym transcriptionally geregelt cAMP Response-Elemente (CREs), so dass es eine attraktive Option für die Beurteilung der OR-Aktivierung. Die Fluoreszenz wird leicht in einer Probe des Kulturmediums nach der Inkubation mit SEAP Erkennung Reagenz24erkannt. Mit dieser Methode charakterisiert die Funktionen der Regionen in äußerster Randlage sowie eine sekundäre Klasse chemosensorische Rezeptoren, ausgedrückt in der OE-die Spur Amin-assoziierte Rezeptoren (TAARs) wurden25,26,27. Eine weitere gängige Methode, die Luciferase Assay verwendet ein Glühwürmchen Luciferase Reporter-gen unter der Kontrolle des cAMP Response-Element (CRE). Messung der Lumineszenz von Luciferase Produktion erzeugt stellt eine effiziente und robuste Möglichkeit zur Quantifizierung OR Aktivierung10,11,28.
Echtzeit-cAMP Assays haben auch verbreitet in dynamisch die Überwachungsfunktion der heterologen oder endogene GPCRs. Ein Beispiel für solche erweiterten Tests nutzt eine genetisch codierte Biosensor-Variante, die eine cAMP-bindende Domäne verschmolzen zu einer mutierten Form der Luciferase besitzt. Wenn Lager bindet, führt die Konformationsänderung zur Aktivierung der Luciferase, Lumineszenz von denen dann mit einem Chemilumineszenz Leser29,30gemessen werden kann. Die Echtzeit-cAMP Technologie ist geeignet für die de-Verwaisung des menschlichen Geruchsstoff Rezeptoren in HEK293 und NxG 108CC15 Zellen berichtet wordenArsch = “Xref” > 31,32,33, wie sowie in die HEK293T abgeleitet Hana3A34,35Zellen. Die Krautwurst-Gruppe auch beschrieben im Detail die Echtzeit-cAMP-Technologie, um für Bi-direktionale groß angelegte oder Screening Ansätze32,33geeignet.
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Messung der OR-Aktivierung mit einem Echtzeit-cAMP-Assay in Hana3A Zellen. In diesem Protokoll wird die Lumineszenz von Pre äquilibriert lebenden Zellen für 30 min. nach der Behandlung mit bestimmten flüchtige Verbindungen, die eine effiziente und genaue Analyse der OR-Aktivierung, die weniger anfällig sind, kinetisch gemessen. Artefakte, die in der zellulären Umgebung mit längerer Zeit und Geruch-induzierte Zelle Toxizitäten auftreten. Diese Echtzeit-Messung ermöglicht eine großangelegte Screening von Regionen in äußerster Randlage und Liganden sowie Charakterisierung von spezifischen OR-Ligand Paaren von Interesse. Mit dieser Methode haben wir erfolgreich OR5AN1 als Rezeptor für den Moschus zusammengesetzten Muscone durch eine Abschirmung gegen 379 menschlichen ORs durchführen und anschließend bestätigen das positive Screening-Ergebnis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genaue Messung eine OR-Aktivierung nach Exposition gegenüber einem bestimmten Geruchsstoff ist der erste Schritt bei der Entschlüsselung der Codierung der Geruchsinformation. Die Experimente gezeigt, die ein Beispiel wie man über ein in-vitro- identifizieren kann, die in dieser Studie OR Expressionssystems, reaktionsschnelle ORs unter dem menschlichen OR Repertoire für die duftende Chemie-und anschließend Charakterisierung des Rezeptors Pharmakologie mit verschiedenen Konzentrationen der Chemikalie. Unsere …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Arbeit wurde von der chinesischen National Science Foundation (31070972), Wissenschaft und Technologie Kommission der Shanghai Municipality (16ZR1418300), das Programm für Innovative Forschung Team des Shanghai Municipal Education Commission, Shanghai östlichen unterstützt. Scholar Program (J50201) und das nationale Grundlagenforschung Programm von China (2012CB910401).
Materials
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Gibco | 10099-141 | |
| GloSensor cAMP reagent | Promega | E1290 | |
| pGloSensor-20F cAMP plasmid | Promega | E1171 | |
| Hana3A cells | available from authors upon request | ||
| HBSS, w/o calcium chloride and magnesium chloride | GIBCO | 14175095 | |
| HEPES | Hyclone | SH30237 | |
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| M3R plasmid | cloned into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| MEM, w/EBSS and w/L-glutamine | Hyclone | SH30024 | |
| Muscone | Santa Cruz | sc-200528 | |
| Musk tibetene | Sigma-Aldrich | S359165 | |
| OR plasmids | cloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| PBS, w/o calcium or magnesium | Cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Plasmid miniprep kit | Tiangen | DP103-03 | |
| Puromycin | Sigma | P8833 | |
| RTP1S plasmid | cloned into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| Trypsin-EDTA | Hyclone | SH30236 | |
| 0.2-mL PCR tube | Axygen | PCR-02-C | |
| 1.5-mL Eppendorf tube | Eppendorf | ||
| 15-mL 17 mm x 120 mm conical tube | BD Falcon | 352096 | |
| 8-well and/or 12-well multichannel pipetman | Eppendorf | ||
| 96-well flat-bottomed white cell culture plate | Greiner | 655098 | |
| 100 mm x 20 mm cell culture dish | BD Falcon | 353003 | |
| Class II biological safety cabinet with laminar flow | |||
| Cell culture incubator, w/ 5% CO2 | |||
| Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes | |||
| Infinite F200 plate reader | Tecan | ||
| Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives | |||
| Spectrophotometer | |||
| Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution | |||
| Sterile paper towel |
References
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