Жить клеточной измерение одоранта рецептор активации с помощью реального времени лагеря Assay
Summary
Характеризующие функцию одоранта рецепторов служит неотъемлемым элементом в процессе deorphanization. Мы описываем метод измерения активацию рецепторов одоранта в режиме реального времени, используя лагеря пробирного.
Abstract
Огромные размеры млекопитающих одоранта рецептор (OR) семей нынешних трудностей найти их родственных лигандам среди многочисленных летучих химических веществ. Чтобы эффективно и точно deorphanize ПРС, мы совмещаем использование гетерологичных клеточной линии выразить млекопитающих СПР и плазмида генетически модифицированных биосенсора для измерения лагеря производства или активации в режиме реального времени. Этот assay может использоваться для экрана отдушки против СПР и наоборот. Позитивные одоранта рецептор взаимодействия с экранов могут быть впоследствии подтверждены тестирование против различных концентрациях запах, генерации концентрация реакция кривых. Здесь мы использовали этот метод для выполнения высокопроизводительного скрининга пахучие соединения против человека или библиотека выражена в Hana3A клетках и подтвердил, что положительно отвечать рецептор родственных рецептор для соединения интереса. Мы нашли этот метод обнаружения высокой пропускной способностью, чтобы быть эффективной и надежной оценки или активации и наши данные представляют собой пример ее возможного использования в или функциональные исследования.
Introduction
Обоняние играет важную роль в выживании животных как они полагаются на их обонятельные способности получить пищу, избежать хищников и опасности, различать виды и выберите мат1,2. Реализация этих функций зависит от рецепторов одоранта (СПР), которые выражаются в отдельности на поверхности цилиарной обонятельной сенсорных нейронов (OSNs) расположен в обонятельного эпителия (OE). СПР составляют крупнейший семейство рецепторов (GPCR) надсемейства G-белка в сочетании с приблизительно 400 и 1200 различных или генов человека и мыши, соответственно3,4,5. СПР, активированную отдушки ведут к повышению внутриклеточного уровня лагеря через последовательное активации обонятельных G-белка (ФООG) и тип III adenylyl циклазы (ACIII). Результате повышенный уровень внутриклеточного лагерь может функционировать как второй messenger, который открывает нуклеотида закрытый канал на поверхности клеток, вызывая приток катионов включая Ca2 + и потенциалы действия и в конечном итоге инициирование Нейро потенциал передачи и обонятельные восприятия. Процесс обнаружения и дискриминацию большое количество отдушки, ORs рассматривается в качестве первого шага обонятельных восприятие6,7.
Поскольку первый бак и Аксель8 успешно клонирован одоранта рецепторов и выяснены механизм восприятия обоняния, инициированных ORs, deorphanization или семьи стал одним из горячих точек в этой области. Различные методы в vivo, ex vivo и in vitro для измерения или активации были сообщил9,10,,1112. Традиционный метод, который используется Ca2 + изображения следуют одной ячейки ПЦР-на OSNs включено выявление различных ORs алифатических отдушки13,14,15. Совсем недавно с появлением крупномасштабных транскриптом анализ способствовал развитию более высокой пропускной способностью в vivo методов. Кентукки пробирного определены ORs эвгенол и отзывчивым Мускон мыши с использованием S100a5-tauGFP репортер мыши деформации и microarray анализ9. Основываясь на снижение уровня мРНК или после экспозиции одорант, мечта технология используется транскриптомики подход, чтобы определить или активации профили в обоих видов позвоночных и не позвоночных16. Аналогичным образом учитывая фосфорилирование S6 в нейрональных активаций, Мацунами группы виртуализированного мРНК из фосфорилированных рибосома immunoprecipitations для идентификации реагировать ORs12. Наконец группе Файнштейн сообщил супер снифер мышей, которые могли бы служить в качестве платформы для изучения запах кодирования в естественных условиях, известный как MouSensor технология17.
В realm в пробирке проблема культивирования OSNs делает гетерологичных выражение системы, которая имитирует или функциональных выражение в vivo идеальное решение для проведения крупномасштабных скрининг пахучих химических веществ для ОРС. Тем не менее поскольку искусственный клеточных линий не обонятельных происхождения отличаются от родной OSNs или белки сохраняются в эндоплазматический ретикулум и не в состоянии движения к плазматической мембраны, что приводит к или деградации и потери функции рецепторов18 , 19. для решения этой проблемы, обширные работы были сделаны для репликации или функциональных выражение на клеточной мембране в гетерологичных клеточных линий. Krautwurst et al. сначала придает первые 20 аминокислот родопсина (Ро тег) N-стержня или белка, и это способствовало клетк поверхности выражение некоторых ОРС в клетки человеческого эмбриона почек (ГЭС)20. Путем проведения последовательного анализа ген выражение (SAGE) библиотека анализа от одного OSNs, Сайто и др. Первые клонированные транспортировки рецептор белков (RTP) членов семьи, RTP1 и RTP2 и рецепторы трансферина выражение усилитель 1 (REEP1), или людьми с клеточной мембраны и повысило одоранта опосредованной ответы ORs в HEK293T клетках 21. Основываясь на этих выводах, Мацунами группа успешно создана линия клеток Hana3A, стабильно transfected сФОО RTP1, RTP2, REEP1 и Gα в HEK293T и временно transfected с меткой Ро СПР, для эффективного или функциональных выражение. Последующие исследования показали 1) короче форма RTP1, RTP1S, могли бы более энергично содействовать или работать чем оригинальный RTP1 белка и 2 тип 3 мускариновых ацетилхолиновый рецептор (M3R), которые могли бы укрепить деятельность или через ингибитирование β-arrestin-2 вербовка, оба из которых были введены к системе гетерологичных выражение для оптимизации экспериментальный выход22,23.
Некоторые методы обнаружения были использованы для количественной оценки активации рецептора в гетерологичных систем. Assay секретируемые плацентарной щелочной фосфатазы (СЕАП) работает с репортером фермента транскрипционно регулируется лагеря ответ элементов (КРЕС), что делает его привлекательным вариантом для оценки или активации. Флюоресценция легко обнаруживается в выборке из питательной среды после инкубации с СЕАП обнаружения реагент24. С помощью этого метода, функции СПР, а также среднего класса влагалище рецепторов, выраженная в OE-трассировки, которые Амин связанные рецепторы (TAARs) были охарактеризованы25,,2627. Другой общий метод, Люцифераза assay, использует Светлячок Люцифераза Репортер ген под контролем лагеря ответ элемента (КРР). Измерения люминесценции, порожденных Люцифераза производства обеспечивает эффективные и надежные средства количественного или активации10,11,28.
Реальном времени лагеря анализов также широко используется в динамически мониторинг функции гетерологичных или эндогенных GPCR. Одним из примеров таких передовых анализов использует генетически закодированный биосенсор вариант, который обладает сплавили мутантные формы Люцифераза домен лагерь привязки. Когда лагерь связывает, конформационные изменения приводит к активации Люцифераза, люминесценции, из которого затем может быть измерена с хемилюминесценции читателя29,30. Реального времени лагеря технологии было сообщено подходит для исключения из сирот человека одоранта рецепторы в клетках 108CC15 HEK293 и NxGпопка = «внешней» > 31,,3233, как хорошо, как и HEK293T-производные Hana3A клетки34,35. Krautwurst группа также подробно описано в реальном времени лагеря технологии пригодны для двунаправленного крупномасштабных или отбора подходы32,33.
Здесь мы описываем протокол для измерения или активации с помощью реального времени пробирного лагеря в Hana3A клетках. В этом протоколе люминесценция предварительно уравновешенной живых клеток измеряется кинетически 30 мин после лечения с конкретными летучих соединений, представляющих более эффективный и точный анализ или активации, которые менее чувствительны к артефакты, возникающие в клеточной среды с длительное время и запах индуцированной клеток токсичности. Это измерение в реальном времени позволяет для крупномасштабных скрининг СПР и лигандами, а также характеристика конкретных пар или лиганд интерес. С помощью этого метода, мы успешно определили OR5AN1 как рецептор для составных Мускон мускус, выполняя скрининг против 379 людские ORs и впоследствии подтверждающий результат положительный скрининга.
Protocol
Representative Results
Discussion
Точного измерения или активации под воздействием определенных одоранта является первым шагом в расшифровке кодирование обонятельной информации. Экспериментов показано в этом исследовании представляют пример того, как можно определить, используя в пробирке или выражение систем…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа была поддержана Китайский Национальный научный фонд (31070972), Наука и технологии Комиссии Шанхае муниципалитет (16ZR1418300), программа для новаторских исследований команда из Шанхая муниципального образования Комиссии, Восточной Шанхай Программа (J50201) и программа национальных базовых исследований Китая (2012CB910401).
Materials
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Gibco | 10099-141 | |
| GloSensor cAMP reagent | Promega | E1290 | |
| pGloSensor-20F cAMP plasmid | Promega | E1171 | |
| Hana3A cells | available from authors upon request | ||
| HBSS, w/o calcium chloride and magnesium chloride | GIBCO | 14175095 | |
| HEPES | Hyclone | SH30237 | |
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| M3R plasmid | cloned into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| MEM, w/EBSS and w/L-glutamine | Hyclone | SH30024 | |
| Muscone | Santa Cruz | sc-200528 | |
| Musk tibetene | Sigma-Aldrich | S359165 | |
| OR plasmids | cloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| PBS, w/o calcium or magnesium | Cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Plasmid miniprep kit | Tiangen | DP103-03 | |
| Puromycin | Sigma | P8833 | |
| RTP1S plasmid | cloned into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| Trypsin-EDTA | Hyclone | SH30236 | |
| 0.2-mL PCR tube | Axygen | PCR-02-C | |
| 1.5-mL Eppendorf tube | Eppendorf | ||
| 15-mL 17 mm x 120 mm conical tube | BD Falcon | 352096 | |
| 8-well and/or 12-well multichannel pipetman | Eppendorf | ||
| 96-well flat-bottomed white cell culture plate | Greiner | 655098 | |
| 100 mm x 20 mm cell culture dish | BD Falcon | 353003 | |
| Class II biological safety cabinet with laminar flow | |||
| Cell culture incubator, w/ 5% CO2 | |||
| Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes | |||
| Infinite F200 plate reader | Tecan | ||
| Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives | |||
| Spectrophotometer | |||
| Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution | |||
| Sterile paper towel |
References
- Malakoff, D. Following the scent of avian olfaction. Science. 286 (5440), 704-705 (1999).
- Zippel, H. P. The ecology of vertebrate olfaction: D.M. Stoddart. Chapman and Hall, Andover, Great Britain, 1980. £15.00, 234 pp. ISBN 0-412-21820-8. Behav Processes. 7 (2), 198-199 (1982).
- Dryer, L., Berghard, A. Odorant receptors: a plethora of G-protein-coupled receptors. Trends Pharmacol Sci. 20 (10), 413-417 (1999).
- Zhang, X., Firestein, S. The olfactory receptor gene superfamily of the mouse. Nat Neurosci. 5 (2), 124-133 (2002).
- Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. The complete human olfactory subgenome. Genome Res. 11 (5), 685-702 (2001).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
- Reed, R. R. After the holy grail: establishing a molecular basis for Mammalian olfaction. Cell. 116 (2), 329-336 (2004).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- McClintock, T. S., et al. In vivo identification of eugenol-responsive and muscone-responsive mouse odorant receptors. J Neurosci. 34 (47), 15669-15678 (2014).
- Trimmer, C., Snyder, L. L., Mainland, J. D. High-throughput analysis of mammalian olfactory receptors: measurement of receptor activation via luciferase activity. J. Vis. Exp. (88), e51640 (2014).
- Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Sci Signal. 2 (60), ra9 (2009).
- Jiang, Y., et al. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo. Nat Neurosci. 18 (10), 1446-1454 (2015).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
- Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 4040-4045 (1999).
- Kajiya, K., et al. Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. J Neurosci. 21 (16), 6018-6025 (2001).
- von der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Nat Neurosci. 18 (10), 1455-1463 (2015).
- D’Hulst, C., et al. MouSensor: A Versatile Genetic Platform to Create Super Sniffer Mice for Studying Human Odor Coding. Cell Rep. 16 (4), 1115-1125 (2016).
- Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. Endoplasmic reticulum retention, degradation, and aggregation of olfactory G-protein coupled receptors. Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).
- McClintock, T. S., et al. Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors. Brain Res Mol Brain Res. 48 (2), 270-278 (1997).
- Krautwurst, D., Yau, K. W., Reed, R. R. Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. Cell. 95 (7), 917-926 (1998).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors. J Biol Chem. 282 (20), 15284-15293 (2007).
- Li, Y. R., Matsunami, H. Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling. Sci Signal. 4 (155), ra1 (2011).
- Durocher, Y., et al. A reporter gene assay for high-throughput screening of G-protein-coupled receptors stably or transiently expressed in HEK293 EBNA cells grown in suspension culture. Anal Biochem. 284 (2), 316-326 (2000).
- Liberles, S. D., Buck, L. B. A second class of chemosensory receptors in the olfactory epithelium. Nature. 442 (7103), 645-650 (2006).
- Saraiva, L. R., et al. Combinatorial effects of odorants on mouse behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (23), E3300-E3306 (2016).
- Nara, K., Saraiva, L. R., Ye, X., Buck, L. B. A large-scale analysis of odor coding in the olfactory epithelium. J Neurosci. 31 (25), 9179-9191 (2011).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3 (9), 1402-1413 (2008).
- Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem Biol. 3 (6), 346-351 (2008).
- Fan, B. F., Wood, K. V. Live-Cell Luminescent Assays for GPCR Studies: Combination of Sensitive Detection and Real-Time Analysis Expands Applications. Genetic Engineering & Biotechnology News. 29, 30-31 (2009).
- Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. A Butter Aroma Recombinate Activates Human Class-I Odorant Receptors. J Agric Food Chem. 63 (43), 9410-9420 (2015).
- Noe, F., et al. OR2M3: A Highly Specific and Narrowly Tuned Human Odorant Receptor for the Sensitive Detection of Onion Key Food Odorant 3-Mercapto-2-methylpentan-1-ol. Chem Senses. 42 (3), 195-210 (2016).
- Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2,4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods. Chem Senses. 42 (3), 181-193 (2016).
- Duan, X., et al. Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3492-3497 (2012).
- Li, S., et al. Smelling Sulfur: Copper and Silver Regulate the Response of Human Odorant Receptor OR2T11 to Low-Molecular-Weight Thiols. J Am Chem Soc. , (2016).
- Wu, L., Pan, Y., Chen, G. Q., Matsunami, H., Zhuang, H. Receptor-transporting protein 1 short (RTP1S) mediates translocation and activation of odorant receptors by acting through multiple steps. J Biol Chem. 287 (26), 22287-22294 (2012).
- Shirasu, M., et al. Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors. Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).
- Block, E., et al. Implausibility of the vibrational theory of olfaction. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), E2766-E2774 (2015).
- Sato-Akuhara, N., et al. Ligand Specificity and Evolution of Mammalian Musk Odor Receptors: Effect of Single Receptor Deletion on Odor Detection. J Neurosci. 36 (16), 4482-4491 (2016).
- Gane, S., et al. Molecular vibration-sensing component in human olfaction. PLoS One. 8 (1), e55780 (2013).
- Young, J. M., et al. Different evolutionary processes shaped the mouse and human olfactory receptor gene families. Hum Mol Genet. 11 (5), 535-546 (2002).
