In Vitro Ensaio de bioluminescência para caracterizar o ritmo circadiano em células epiteliais mamárias
Summary
Um ensaio de bioluminescência em vitro para determinar celular ritmo circadiano em células epiteliais mamárias é apresentado. Este método utiliza plasmídeos de repórter de pilha mamífera expressando desestabilizado luciferase sob o controle do promotor do gene de período 2 . Ele pode ser adaptado para outros tipos de células para avaliar efeitos de órgãos específicos no ritmo circadiano.
Abstract
O ritmo circadiano é um fundamental processo fisiológico presente em todos os organismos que regula os processos biológicos, variando de expressão gênica de comportamento de dormir. Nos vertebrados, ritmo circadiano é controlado por um oscilador molecular que funciona no núcleo supraquiasmático (SCN; marcapasso central) e composto por tecidos mais periféricos de células individuais. Mais importante ainda, perturbação do ritmo circadiano pela exposição à luz durante a noite, estressores ambientais e/ou substâncias tóxicas é associada com aumento do risco de doenças crônicas e envelhecimento. A capacidade de identificar os agentes que podem prejudicar a centrais e/ou periféricos relógios biológicos e agentes que podem prevenir ou atenuar os efeitos da perturbação circadiano, tem implicações significativas para a prevenção de doenças crônicas. Embora modelos de roedores podem ser usados para identificar riscos e agentes que induzem ou impedem/atenuar perturbações circadiana, estas experiências exigem um grande número de animais. Estudos in vivo também necessitam de infra-estrutura e recursos significativos e exigem que os investigadores a trabalhar a noite toda. Assim, há uma necessidade urgente de um tipo de célula adequado em vitro sistema de tela para os disruptores circadianos ambientais e realçadores em tipos de células de diferentes órgãos e Estados de doença. Nós construímos um vetor que impulsiona a transcrição da luciferase desestabilizado em células eucarióticas, sob o controle do promotor gene período 2 humano. Essa construção circadian repórter foi estàvel transfected em células epiteliais mamárias humanas, e células circadian repórter responsivos foram Selecionadodas para desenvolver o ensaio de bioluminescência em vitro . Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para estabelecer e validar o ensaio. Nós fornecemos mais detalhes para a prova de experimentos de conceito, demonstrando a capacidade do nosso ensaio em vitro de recapitular na vivo efeitos de vários produtos químicos sobre o celular relógio biológico. Os resultados indicam que o ensaio pode ser adaptado a uma variedade de tipos de células para a tela para ambos os disruptores ambientais e quimiopreventivo potenciadores de relógios circadianos.
Introduction
O relógio circadiano regula uma ampla gama de processos biológicos de diurna expressão de genes para dormir o comportamento em um ritmo previsível com uma periodicidade de aproximadamente 24 h. epidemiológico estudos sugerem fortemente que perturbação crônica de circadiano ritmo aumenta o risco de cancro da mama e da próstata em trabalhadores de turno, incluindo enfermeiros e tripulações de voo a1,2,3. Esses achados são corroborados por estudos de roedores, demonstrando que a exposição aos ciclos de luz durante a noite, ou luz luz constante, que imitam a incidência de tumor de jet-lag aumento e acelera o crescimento de tumor4,5. Com base em dados de estudos humanos e roedores, a Agência Internacional para pesquisa sobre câncer classificados trabalho por turnos como um provável carcinogênico humano (tipo 2A) em 20106.
Anteriormente, temos demonstrado que uma dose única de cancerígena de carcinógeno específico tumor mamário, N– nitroso-N– methylurea (NMU), interrompeu a expressão circadiana dos principais genes circadianos (CGs) (por exemplo, período 2 , Per2) e vários circadian controlado por genes (CCGs), incluindo danos ao DNA responsivo-chave e reparar os genes (DDRR) na glândula mamária alvo (mas não no fígado). Além disso, redefinindo a expressão circadiana dos genes tanto Per2 e DDRR no sentido normal por um regime quimiopreventivo de dietético L-metil-selenocisteína (MSC) reduziu a incidência de tumor em 63%. Estas conclusões foram os primeiros a mostrar um link mecanicista entre ritmo circadiano, carcinogênese química e Quimioprevenção7,8. Riscos em relação a outros tóxicos ambientais mostrados interromper genética circadian expressão na vivo também estão associados com risco aumentado de doenças ambientais9,10. Compreender os mecanismos que vinculam circadian interrupção por tóxicos ambientais e patogênese pode originar abordagens mecanicamente para a prevenção de doenças. No entanto, estudos destinados a definir as interacções entre as exposições e ritmo circadiano geralmente são realizadas in vivo. Um típico na vivo experimento a investigar que o impacto sobre o ritmo circadiano requer um grande número de animais, como os tecidos de pelo menos três controlam e três animais expostos devem ser coletados a cada 3-4 h durante um período de 24 ou 48 h. Desenvolvimento de um sistema validado em vitro que recapitula as observações na vivo e mecanismos que, por conseguinte, não só reduzir o número de animais necessários, mas também dramaticamente reduzir custos experimentais e a exigência que pesquisadores trabalham continuamente ao longo de um período de 24-48 h. Além disso, um sistema validado em vitro poderia ser usado para o rastreio de alta taxa de transferência de compostos e/ou alteração genética que afetam o ritmo circadiano, ou sua resposta a estressores ambientais ou substâncias tóxicas. Portanto, a combinação estratégica de modelos in vitro e in vivo e experiências são necessárias para obter insights diferentes com foco diferente.
Nos mamíferos, osciladores circadianos existem não só nos neurônios especializados do SCN, mas também em tipos de células mais periféricos. Estes pulsos de disparo moleculares são similares em linhas de células de fibroblastos estabelecida e em fibroblastos primários de embriões ou animais adultos; no entanto, há uma necessidade de tecido celular modelos específicos do tipo11. Consequentemente, estudos tradicionais da atividade locomotora em vivo, SCN explants ex vivoe ensaios baseados em células em vitro em células de fibroblastos imortalizado são amplamente utilizados para estudar a célula autónomos defeitos circadianos. No entanto, não há provas indicando que um em vitro fibroblasto baseada em célula ensaio pode recapitular circadianos mecanismos e respostas presentes em células de outros órgãos periféricos na vivo. Diferentes tipos de células podem ter padrões distintos de expressão gênica, metabolismo e DDRR, e as ligações entre a toxicidade e a expressão genética circadian podem ser o tipo de célula específica e/ou modulada por diferentes parâmetros fisiológicos. Além disso, osciladores circadianos em sistemas baseados em fibroblasto não foram totalmente avaliados para respostas a tóxicos ambientais, estressores e agentes preventivos que ligam as exposições aos mecanismos de desenvolvimento de doenças e prevenção. Assim, há uma necessidade de facile, validado-tipo de células específicas, em vitro bioluminescência ensaios para estudar órgão específico ambiental circadian os disruptores. Apesar de ter uma variedade de modelos de relógio celular (por exemplo, no fígado, queratinócitos e as células de gordura, bem como uma linha de celular de osteossarcoma) foram desenvolvidas nos últimos anos12,13,14, 15, o ensaio descrito aqui é o primeiro modelo de relógio celular em células epiteliais da mama e a primeira demonstração de recapitular na vivo respostas a estressores ambientais, substâncias tóxicas, drogas e agentes quimiopreventivo.
Renilla luciferase (rLuc) e a luciferase de vaga-lume são 30-61 kDa proteínas monoméricas que não exigem posttranslational de processamento para a atividade enzimática e podem funcionar como um repórter genética imediatamente após a tradução. Uma vez que o substrato associa-se com a enzima luciferase, a reação bioquímica catalisada gera um flash de luz. Assim, a luciferase construções são amplamente utilizadas como um gene expressão repórter sistema em vitro e in vivo. No entanto, em estudos de ritmo circadiano, o utilitário do repórter do luciferase é limitado pelo relativamente longo Half-Life da proteína luciferase (T1/2 = h 3,68) relativamente ao período (especialmente para o período curto) para que as alterações no gene circadian expressão; no entanto, numerosos estudos ao longo dos anos usaram com sucesso o gene da luciferase no vetor pGL3, indicando que a luciferase rapidamente degradável pode não ser necessário para relatórios dos ritmos circadianos, especialmente para os ritmos com um período mais longo, tais como 24 h. Portanto, um repórter do usando vetor de luciferase desestabilizado, pGL [Luc2P/Neo], que contém hPEST (uma sequência de desestabilização da proteína) foi desenvolvido, permitindo-nos usá-lo como um vetor de repórter circadiano para nosso atual in vitro ensaio de bioluminescência. A proteína codificada pelo Luc2P tem uma meia-vida mais curta (T1/2 = 0,84 h) e, portanto, responde mais rapidamente e com uma maior amplitude a alterações na atividade transcricional do selvagem-tipo, eundicating que pode ser usado para monitorar a expressão rítmica da luciferase regulado pelo promotor PER2 com precisão em tempo real16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Em células de mamíferos, periodicidade do relógio circadiano é regulada por loops de feedback transcriptional/translacional interconectadas. Heterodímeros de Bmal1 e o relógio ou o Npas2 regular circadian transcrição por ligação aos promotores do núcleo CGs, incluindo Per2 e chorare numerosos CCGs4elementos E-caixa. Como eles se acumulam na célula, heterodímeros de por: Cry post-translationally são modificados e transportados para o núcleo para reprimir a atividade…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela sociedade 2012 de toxicologia (SOT)-Colgate Palmolive Grant para pesquisa Alterative (M. Fang) e a pesquisa de colaboração internacional fundo de Animal e planta agência de quarentena, República da Coreia (M. Fang), e conceder as NIEHS P30ES005022 (H. Zarbl). Gostaríamos de agradecer o Dr. Zheng Chen (McGovern escola médica da Universidade do Texas Health Science Center em Houston) para sua discussão útil, Sr. Juan de Shao-An por sua assistência experimental e a Sra. Kimi Nakata para a leitura de prova.
Materials
| pLS[hPER2P/rLuc/Puro] vector | SwitchGear Genomics | S700000 | customized vector |
| pGL4.18[Luc2P/Neo] vector | Promega | 9PIE673 | destabilized luciferase expression vector |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224041 | For subcloning |
| TOPO TA cloning kit | Invitrogen | K4500-02 | with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli |
| Sac I | New England BioLabs | R0156S | Restriction enzyme |
| Hind III-HF | New England BioLabs | R3104S | Restriction enzyme |
| CutSmart buffer | New England BioLabs | B7204S | Restriction enzyme buffer |
| DNA gel extraction kit | Qiagen | 28704 | Purify DNA fragments from agarose gel |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA clean up |
| LB Miller's modification | TEKNOVA | L8600 | For transformed E. Coli culture |
| LB Agar Plate | TEKNOVA | L1902 | For white/blue selection |
| QIAprep spin miniprep Kit | Qiagen | 27104 | For extraction of plasmide DNA |
| EndoFree plasmid maxi prep Kit | Qiagen | 12362 | For extraction of plasmide DNA |
| FuGene HD | Promega | E2311 | Transfection reagent |
| Opti-MEM reduced serum medium | Invitrogen | 31985-062 | For transfection |
| MCF10A cell line | American Type Culture Collection | CRL-10317 | Mammary Epithelial Cells |
| MEGM BulletKit | Lonza | CC-3150 | Mammary Epithelial Growth Medium |
| MEBM | Lonza | CC-3151 | Mammary Epithelial Basal Medium |
| MEGM SingleQuot Kit | Lonza | CC-4136 | Suppliments & Growth Factors |
| ReagentPack | Lonza | CC-5034 | Reagent for subculture |
| D-PBS (10X) | Sigma | D1408 | Wash cells in culture dishes |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977 | Dilute 10X D-PBS |
| Tissue culture dish (35 mm) | BD/Falcon | 353001 | cell culture dish suitable to LumiCycle |
| Silicon grease | Fisher | NC9044707 | For sealing dish with recording medium |
| Round cover glass | Harvard Bioscience | 64-1500 (CS-40R) | For sealing dish with recording medium |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Supplement for growth medium |
| G418 sulfate (Geniticin) | Invitrogen | 10131035 | Antibiotic for selection of stabliy transfected cells |
| Ampicillin | Sigma | A9393 | For colony selection |
| Forskolin | Sigma | F6886 | Synchronization agent |
| Melatonin | Sigma | M5250 | Synchronization agent |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Synchronization agent |
| Horse serum | Sigma | H1138 | Synchronization agent |
| d-Luciferin, sodium salt | Invitrogen | L2912 | Luciferase substrate |
| IC261 | Sigma | 10658 | Positive control for circadian disruptor |
| Methylnitrosourea (NMU) | Sigma | N1517 | Mammary specific carcinogen |
| Methylselenocysteine (MSC) | Sigma | M6680 | Organic selenium (chemopreventive agent) |
| EX527 | Sigma | E7034 | SIRT1 specific inhibitor |
| Cambinol | Sigma | C0494 | SIRT1 & SIRT2 inhibitor |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 8000 | Quantify nucleotide |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | N805-0200 | For molecular biology experiment |
| CO2 Incubator | NAPCO | Series 8000 DH | For cell culture at 5% CO2 at 37 °C |
| Desktop centrifuge with refrezerator | Eppendorf | 5430R | For molecular biology experiment |
| Centrifuge with swing bucket | Eppendorf | 5810 R | For cell culture |
| Inverted microscope | Nikon | 80124 | Phase contrast optional |
| Tissue culture hood | Labconco | Class II A2 | BSL-2 certified |
| LumiCycle 32 | Actimetrics | Not Available | Luminoscence detector |
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