In Vitro Test de bioluminescence pour caractériser le rythme circadien dans les cellules épithéliales mammaires
Summary
Un test de bioluminescence in vitro afin de déterminer des rythme circadien cellulaire dans les cellules épithéliales mammaires est présenté. Cette méthode utilise des plasmides de journaliste de cellules de mammifères exprimant déstabilisé luciférase sous le contrôle du promoteur du gène de la période 2 . Il peut être adapté à d’autres types de cellules pour évaluer les effets spécifiques sur le rythme circadien.
Abstract
Le rythme circadien est un processus physiologique fondamentaux présent dans tous les organismes qui régule les processus biologiques allant de l’expression des gènes au comportement de sommeil. Chez les vertébrés, le rythme circadien est contrôlé par un oscillateur moléculaire qui fonctionne dans le noyau suprachiasmatique (YVERT ; stimulateur central) et des cellules individuelles comprenant les tissus plus périphériques. Plus important encore, la perturbation du rythme circadien par l’exposition à la lumière nuit, facteurs de stress environnementaux et/ou des substances toxiques est associée à un risque accru de maladies chroniques et le vieillissement. La capacité d’identifier les agents qui peuvent perturber les horloges biologiques centrales ou périphériques et qui peut prévenir ou atténuer les effets de désorganisation du rythme circadienne, a des implications importantes pour la prévention des maladies chroniques. Bien que les modèles de rongeurs peuvent servir à identifier les expositions et les agents qui induisent ou à prévenir ou atténuer les perturbations circadiennes, ces expériences nécessitent un grand nombre d’animaux. Des études in vivo aussi requièrent l’infrastructure et des ressources importantes et les chercheurs à travailler toute la nuit. Ainsi, il est un besoin urgent d’un type cellulaire appropriée en vitro système pour dépister les environnementales endocriniens circadiennes et exhausteurs de types de cellules de différents organes et états pathologiques. Nous avons construit un vecteur qui anime la transcription de la luciférase déstabilisé dans les cellules eucaryotes sous le contrôle du promoteur du gène humain des période 2 . Cette construction de rythme circadien journaliste était stablement transfectée dans des cellules épithéliales mammaires humaines et cellules circadienne journaliste sensible ont été sélectionnés pour développer le test de bioluminescence in vitro . Nous présentons ici un protocole détaillé afin d’établir et de valider le test. Nous fournissons plus amples détails pour preuve d’expériences de concept démontrant la capacité de notre essai in vitro à récapituler les effets in vivo de divers produits chimiques sur l’horloge biologique cellulaire. Les résultats indiquent que le test peut être adapté à une variété de types de cellules à l’écran pour les perturbateurs endocriniens environnementaux et exhausteurs chimiopréventif des horloges circadiennes.
Introduction
L’horloge circadienne réglemente un large éventail de processus biologiques de diurne expression des gènes dormir comportement dans un rythme prévisible avec une périodicité d’environ 24 h. épidémiologique études suggèrent fortement que les perturbations chroniques du rythme circadien rythme augmente le risque de cancer du sein et cancer de la prostate dans les travailleurs de quarts, y compris les infirmières et les équipages de vol1,2,3. Ces résultats sont corroborés par des études sur les rongeurs, ce qui démontre que l’exposition aux cycles de lumière nuit ou lumière de lumière constante, qui imitent l’incidence des tumeurs au décalage augmentation et accélère la croissance de tumeur4,5. Basé sur des données issues des études humaines et rongeurs, le Centre International de recherche sur le Cancer a classé travail par quarts comme un carcinogène humain probable (Type 2 a) en 2010,6.
Auparavant, nous avons démontré qu’une dose unique de cancérogène de la tumeur mammaire spécifique comme agent cancérigène, N– nitroso-N– méthylurée (NMU), perturbé l’expression circadienne des principaux gènes circadiens (CGs) (p. ex., période 2 , Per2) et plusieurs circadienne contrôlée par gènes (NGCC), y compris les principales lésions de l’ADN réactive et réparer les gènes (DDRR) dans la glande mammaire de la cible (mais pas dans le foie). Réinitialisation de plus, l’expression circadienne des gènes Per2 et DDRR vers la normale par un régime chemopreventive de diététique L-méthyl-sélénocystéine (MSC) a réduit l’incidence de tumeur de 63 %. Ces résultats ont été les premiers à montrer un lien mécaniste entre rythme circadien, cancérogenèse chimique et chimioprévention7,8. Exposition aux autres toxiques environnementaux semblent perturber circadienne gene expression in vivo est également associée à un risque accru de maladies environnementales9,10. Comprendre les mécanismes qui lient la désorganisation circadienne de substances toxiques environnementales et la pathogenèse peut conduire à des approches mécaniste de la prévention des maladies. Toutefois, des études visant à définir les interactions entre les expositions et rythme circadien sont généralement effectués in vivo. Un typique en vivo expérience étudie que l’impact sur le rythme circadien nécessite un grand nombre d’animaux, comme le contrôlent de tissus provenant d’au moins trois et trois animaux exposés doivent être prélevés tous les 3-4 h sur une période de 24 ou 48 h. Développement d’un système validé in vitro qui récapitule en vivo observations et mécanismes serait donc non seulement de réduire le nombre d’animaux nécessaires, mais également considérablement réduire coûts expérimentales et l’exigence qui les chercheurs travaillent en permanence sur une période de 24 à 48 h. En outre, un système validé in vitro pourrait servir pour le criblage à haut débit des composés et/ou des altérations génétiques qui influent sur le rythme circadien, ou sa réponse aux facteurs de stress environnementaux ou de substances toxiques. Par conséquent, la combinaison stratégique de modèles in vitro et in vivo et expériences sont nécessaires pour obtenir différents points de vue avec une orientation différente.
Chez les mammifères, les oscillateurs circadiens existent non seulement dans les neurones spécialisés du SCN, mais aussi dans les types de cellules plus périphériques. Ces horloges moléculaires sont semblables à ceux dans les lignées cellulaires établies des fibroblastes et primaire fibroblastes d’embryons ou d’animaux adultes ; Cependant, il y a un besoin de tissu modèles cellulaires spécifiques au type11. Par conséquent, les études traditionnelles de l’activité locomotrice dans vivo, YVERT explants ex vivo, et basés sur les cellules in vitro tests dans les cellules de fibroblaste immortalisées sont largement utilisés pour étudier les cellules autonomes défauts circadiennes. Cependant, il n’y a aucune preuve indiquant qu’un dosage de cellulaire des fibroblastes in vitro peut récapituler les mécanismes circadiennes et réponses présent dans les cellules des autres organes périphériques en vivo. Différents types de cellules peuvent avoir des profils distincts de DDRR, métabolisme des xénobiotiques et l’expression des gènes, et les liens entre la toxicité et l’expression des gènes circadiens peuvent être de type cellulaire spécifique et/ou modulé par différents paramètres physiologiques. En outre, oscillateurs circadiens dans des systèmes axés sur les fibroblastes n’ont pas été dûment évalués de réponses aux substances toxiques environnementaux, les facteurs de stress et les agents préventifs qui relient les expositions à des mécanismes de prévention et de développement de la maladie. Ainsi, il y a un besoin spécifique de type cellulaire facile, validés et in vitro des épreuves bioluminescence pour étudier l’orgue spécifique environnement circadienne des perturbateurs. Bien qu’une variété de modèles d’horloge cellulaire (par exemple, dans le foie, les kératinocytes, cellules adipeuses, ainsi une lignée de cellules d’ostéosarcome) ont été développés au cours des dernières années12,13,14, 15, l’essai décrit ici est le premier modèle d’horloge cellulaire dans les cellules épithéliales mammaires et la première démonstration de récapituler en vivo réponses aux facteurs de stress environnementaux, substances toxiques, des médicaments et agents chimopréventifs.
Renilla luciférase (rLuc) et la luciférase firefly sont les protéines de monomère 30-61 kDa qui ne nécessitent pas de posttranslational de traitement à l’activité enzymatique et peuvent fonctionner comme un journaliste génétique dès sa traduction. Une fois que le substrat s’associe à l’enzyme luciférase, la réaction biochimique catalysée génère un éclair de lumière. Ainsi, les constructions de luciférase sont largement utilisées comme un gène expression journaliste système in vitro et in vivo. Toutefois, dans les études de rythme circadien, l’utilité du reporter de la luciférase est limitée par la demi-vie relativement longue de la protéine de la luciférase (T1/2 = 3,68 h) par rapport à la période (en particulier pour la courte période) pour les changements de rythme circadien gène expression ; Cependant, de nombreuses études au cours des années ont utilisé avec succès le gène de la luciférase dans le vecteur pGL3, indiquant que la luciférase rapidement dégradable n’est peut-être pas nécessaire pour la déclaration des rythmes circadiens, en particulier pour les rythmes avec une période plus longue, tels que 24h. Par conséquent, un plasmide de journaliste à l’aide de vecteur de la luciférase déstabilisé, pGL [Luc2Pcopié], qui contient des hPEST (une séquence de déstabilisation de protéine) a été développé, ce qui nous permet de l’utiliser comme un vecteur de rythme circadien reporter pour notre actuel in vitro test de bioluminescence. La protéine codée par Luc2P a une demi-vie beaucoup plus courte (T1/2 = 0,84 h) et donc, répond plus rapidement et avec une plus grande ampleur aux changements dans l’activité transcriptionnelle de type sauvage, j’aindicating qu’il peut être utilisé pour surveiller l’expression rythmique de la luciférase réglementé par le promoteur PER2 avec précision en temps réel16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans les cellules de mammifères, périodicité de l’horloge circadienne est régulée par des boucles de rétroaction transcriptionnelle/translationnelle interconnectés. Hétérodimères de Bmal1 et horloge ou Npas2 réglementer circadienne transcription en se liant à des éléments d’armoire dans les promoteurs de base CGs, y compris nombreux NGCC4 Per2 et cri. Comme ils s’accumulent dans la cellule, hétérodimères de par : cri sont sera modifié et transportés vers…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la société de toxicologie du 2012 (SOT)-Colgate Palmolive Grant pour la recherche alternative (M. Fang) et la recherche de collaboration internationale fonds de Animal and Plant quarantaine Agency, République de Corée (M. Fang), et accorde le du NIEHS P30ES005022 (H. Zarbl). Nous tenons à remercier le Dr Zheng Chen (McGovern Medical School de l’Université du Texas Health Science Center à Houston) pour son exposé utile, M. Juan de Shao-An pour son aide expérimentale et Mme Kimi Nakata pour sa relecture.
Materials
| pLS[hPER2P/rLuc/Puro] vector | SwitchGear Genomics | S700000 | customized vector |
| pGL4.18[Luc2P/Neo] vector | Promega | 9PIE673 | destabilized luciferase expression vector |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224041 | For subcloning |
| TOPO TA cloning kit | Invitrogen | K4500-02 | with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli |
| Sac I | New England BioLabs | R0156S | Restriction enzyme |
| Hind III-HF | New England BioLabs | R3104S | Restriction enzyme |
| CutSmart buffer | New England BioLabs | B7204S | Restriction enzyme buffer |
| DNA gel extraction kit | Qiagen | 28704 | Purify DNA fragments from agarose gel |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA clean up |
| LB Miller's modification | TEKNOVA | L8600 | For transformed E. Coli culture |
| LB Agar Plate | TEKNOVA | L1902 | For white/blue selection |
| QIAprep spin miniprep Kit | Qiagen | 27104 | For extraction of plasmide DNA |
| EndoFree plasmid maxi prep Kit | Qiagen | 12362 | For extraction of plasmide DNA |
| FuGene HD | Promega | E2311 | Transfection reagent |
| Opti-MEM reduced serum medium | Invitrogen | 31985-062 | For transfection |
| MCF10A cell line | American Type Culture Collection | CRL-10317 | Mammary Epithelial Cells |
| MEGM BulletKit | Lonza | CC-3150 | Mammary Epithelial Growth Medium |
| MEBM | Lonza | CC-3151 | Mammary Epithelial Basal Medium |
| MEGM SingleQuot Kit | Lonza | CC-4136 | Suppliments & Growth Factors |
| ReagentPack | Lonza | CC-5034 | Reagent for subculture |
| D-PBS (10X) | Sigma | D1408 | Wash cells in culture dishes |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977 | Dilute 10X D-PBS |
| Tissue culture dish (35 mm) | BD/Falcon | 353001 | cell culture dish suitable to LumiCycle |
| Silicon grease | Fisher | NC9044707 | For sealing dish with recording medium |
| Round cover glass | Harvard Bioscience | 64-1500 (CS-40R) | For sealing dish with recording medium |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Supplement for growth medium |
| G418 sulfate (Geniticin) | Invitrogen | 10131035 | Antibiotic for selection of stabliy transfected cells |
| Ampicillin | Sigma | A9393 | For colony selection |
| Forskolin | Sigma | F6886 | Synchronization agent |
| Melatonin | Sigma | M5250 | Synchronization agent |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Synchronization agent |
| Horse serum | Sigma | H1138 | Synchronization agent |
| d-Luciferin, sodium salt | Invitrogen | L2912 | Luciferase substrate |
| IC261 | Sigma | 10658 | Positive control for circadian disruptor |
| Methylnitrosourea (NMU) | Sigma | N1517 | Mammary specific carcinogen |
| Methylselenocysteine (MSC) | Sigma | M6680 | Organic selenium (chemopreventive agent) |
| EX527 | Sigma | E7034 | SIRT1 specific inhibitor |
| Cambinol | Sigma | C0494 | SIRT1 & SIRT2 inhibitor |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 8000 | Quantify nucleotide |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | N805-0200 | For molecular biology experiment |
| CO2 Incubator | NAPCO | Series 8000 DH | For cell culture at 5% CO2 at 37 °C |
| Desktop centrifuge with refrezerator | Eppendorf | 5430R | For molecular biology experiment |
| Centrifuge with swing bucket | Eppendorf | 5810 R | For cell culture |
| Inverted microscope | Nikon | 80124 | Phase contrast optional |
| Tissue culture hood | Labconco | Class II A2 | BSL-2 certified |
| LumiCycle 32 | Actimetrics | Not Available | Luminoscence detector |
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