Un test d’Inhibition (HI) hémagglutination optimisé pour quantifier les titres d’anticorps spécifiques à la grippe
Summary
Les protocoles présentés décrivent comment effectuer un test d’inhibition hémagglutination afin de quantifier les titres d’anticorps spécifiques à la grippe d’échantillons de sérum des destinataires de vaccin contre la grippe. Le premier dosage détermine la concentration optimale d’antigène viral par hémagglutination. Le deuxième essai quantifie les titres d’anticorps spécifiques à la grippe par l’inhibition de l’hémagglutination.
Abstract
Les titres d’anticorps sont couramment utilisés comme marqueurs de substitution pour protection sérologique contre la grippe et d’autres agents pathogènes. Une connaissance approfondie de la production d’anticorps avant et après la vaccination est nécessaire pour comprendre l’immunité induite par le vaccin. Cet article décrit un protocole fiable de point par point afin de déterminer les titres d’anticorps spécifiques à la grippe. Le premier protocole décrit une méthode pour spécifier les montants d’antigène nécessaires d’hémagglutination, qui standardise les concentrations pour une utilisation ultérieure dans le second protocole (test d’hémagglutination, HA test). Le deuxième protocole décrit la quantification des titres d’anticorps spécifiques à la grippe contre différentes souches virales en utilisant une dilution en série de humaine sérique ou cellule surnageants de culture (hemagglutination inhibition test, test HI).
Ainsi appliquée, nous montrons la réponse en anticorps d’une cohorte en bonne santé, qui a reçu un vaccin antigrippal inactivé trivalent. En outre, la réactivité croisée entre les différents virus apparaît et méthodes pour minimiser les réactions croisées à l’aide de différents types d’animaux des globules rouges (hématies) sont expliquées. Le débat met en évidence les avantages et les inconvénients des essais présentés et comment la détermination des titres d’anticorps spécifiques à la grippe peut améliorer la compréhension de l’immunité liée au vaccin.
Introduction
Infection par le virus de la grippe est associée à une morbidité considérable, la mortalité et des coûts de santé élevés1,2,3,4. En particulier, personnes âgées, nouveaux-nés, femmes enceintes et les patients atteints de maladie chronique courent le risque de complications cliniques plus sévères. Vaccination contre les souches du virus grippal en circulation est donc la principale mesure d’alléger le fardeau de la maladie chez ces populations à risque élevé. L’augmentation de la réponse immunitaire individuelle après la vaccination, par exemple, des anticorps spécifiques à la grippe au-dessus d’un seuil de protection, réduit le risque individuel d’infection, en général la probabilité de transmission du virus au sein d’une population 5. une compréhension détaillée de l’induite par le vaccin immunitaire humorale chez les différentes populations et divers groupes d’âge est un élément clé pour répondre à des questions cliniques importantes6,7,8 , 9, telles que : pourquoi certains patients âgés ont-ils des infections malgré la vaccination précédente ? Ce qui est une protection induite par le vaccin « bonne » et « suffisante » ? Combien de fois un vaccin devraient-elles s’appliquer à un patient immunodéprimés rejoindre des titres protecteurs ? Quel est le dosage plus efficace ? Quel est l’impact d’un nouvel adjuvant sur les titres d’anticorps après la vaccination ? La mesure de la production de vaccin spécifique d’anticorps peut aider à répondre à ces questions importantes et d’améliorer les résultats de la vaccination.
La quantification des titres d’anticorps spécifiques du virus peut être effectuée avec différentes méthodes immunologiques. Cela inclut phase solide10 ou axée sur le talon des tests ELISA11 , HI test12et neutralisant essais13. Méthodes ELISA permettent de dépister des quantités relativement importantes de sérums contre les différents antigènes. En outre, immunoglobuline (Ig) M et des IgG spécifiques peuvent être explorées séparément. Bien que les caractéristiques d’un antigène, par exemple, la séquence linéaire d’acides aminés ou les particules virales peuvent influer sur la liaison des anticorps, le spectre des épitopes potentiels est très large et ne fournit pas d’informations sur si un anticorps réponse a pertinence fonctionnelle.
En revanche, le test de neutralisation détermine le potentiel d’anticorps fonctionnellement inhiber l’infection de cellules et reflète par conséquent le potentiel de neutralisation. Toutefois, cette méthode est très demande beaucoup de travail, nécessite la mise en culture du particulier de lignées cellulaires et de vivre virus, et donc, c’est fastidieux, coûteux et nécessite un équipement spécial.
Cet article décrit une étape par étape le HI axée sur l’Organisation mondiale de la santé OMS protocole12 afin de quantifier les titres d’anticorps spécifiques à la grippe. Hémagglutination est un effet caractéristique de certains virus entraînant l’agglutination des érythrocytes. L’inhibition de cet effet avec le sérum du patient permet la mesure des concentrations d’anticorps inhibiteurs, qui reflète un effet neutralisant.
Nous avons modifié le workflow of the WHO-Protocole afin de permettre une gestion plus efficace des échantillons multiples en même temps et en réduisant le temps requis. Le premier protocole décrit la détermination du potentiel d’agglutination d’un antigène spécifique de la grippe. Ce faisant, la concentration de l’antigène grippe correcte est déterminée pour le deuxième protocole. Cette partie doit être répétée avec chaque nouvel antigène viral, ainsi que chaque lot de sang.
Le deuxième protocole décrit la détermination des titres d’anticorps spécifiques à la grippe. Les protocoles présentés sont optimisés pour l’étude des virus de la grippe et des échantillons de sérum humain, cependant, il peut également être appliquée pour les échantillons de sérum de souris ou les surnageants de culture cellulaire de cellules immunitaires stimulées, par exemple, les lymphocytes B spécifiques du virus. Résultats peuvent être déterminées comme des titres mesurés absolues. Dans de nombreuses études de vaccin, les moyenne géométrique des titres et l’intervalle de confiance de 95 % sont indiqués pour chaque population particulière. Pour l’interprétation, la séroprotection ou séroconversion sont souvent utilisés pour décrire la sensibilité d’une population à un certain virus. Séroprotection est définie comme un titre de ≥1:40 et la séroconversion comme un titre de plus de 4 fois augmentent avec la réalisation des titres séroprotecteurs entre deux points dans le temps (le plus souvent avant la vaccination et 30 jours après la vaccination sont utilisés).
Les deux protocoles sont faciles à utiliser et peuvent être adaptés à un large éventail de questions de recherche. En particulier, ils peuvent servir à déterminer rapidement et de façon fiable les titres d’anticorps contre divers autres virus capable d’hémagglutination, telles que la rougeole, Polyomavirus, oreillons ou la rubéole14,15,16 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Quantification des titres d’anticorps spécifiques de pré- et post-vaccinatoires grippe virus est un outil important et nécessaire pour les études de vaccin. Basé sur les mesures de substitution de protection contre l’infection par le virus, comme la séroprotection (> 01:40) ou séroconversion (titre 4 fois augmentation), vaccination stratégies peuvent être optimisés9. En utilisant les protocoles fournis peut déterminer : (i) le potentiel d’hémagglutination d’un virus particulie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
aucun.
Materials
| 25 ml Disposable Multichannel Pipette Reservoirs | Integra | 4312 | |
| 8-well PCR tubes | Brand GMBH | 781332 | For serum aliquots |
| 96-well microtiter plate, U-shaped | TPP | 92097 | For HI assay when using mammalian RBCs |
| 96-well microtiter plate, V-shaped | Corning Costar | 3897 | For HI assay when using avian RBCs |
| Aqua ad iniect. Steril | Bichsel AG | 1000004 | For preparing influenza antigen and cholera filtrate solutions |
| Chicken RBC (10%) | Cedarlane | CLC8800 | 10% suspension of chicken red blood cells in Alsever's solution |
| Cholera filtrate | Sigma-Aldrich | C8772 | Used as receptor destroying enzyme (RDE) |
| Dulbecco's PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | For diluting the serum samples, RBCs and antigens |
| Eppendorf Multichannel pipette, 12-channel, 10-100 µl | Sigma-Aldrich | Z683949 | |
| Eppendorf Multichannel pipette, 8-channel, 10-100 µl | Sigma-Aldrich | Z683930 | |
| Guinea Pig RBC (10%) | Cedarlane | CLC1800 | 10% suspension of guinea pig red blood cells in Alsever's solution |
| Influenza Anti-A/California/7/09 HA serum | NIBSC | 14/134 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-A/Switzerland/9715293/2013-like HA serum | NIBSC | 14/272 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-A/Texas/50/2012-Like HA Serum | NIBSC | 13/178 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-B/Brisbane/60/2008-HA serum | NIBSC | 13/254 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-B/Massachusetts/02/2012 HA serum | NIBSC | 13/182 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza antigen A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) | NIBSC | 12/168 | Inactivated, partially purified A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) virus (ca. 46µgHA/ml) |
| Influenza antigen A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88) | NIBSC | 14/254 | Inactivated, partially purified A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88) virus (ca. 55µgHA/ml) |
| Influenza antigen A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) | NIBSC | 13/112 | Inactivated, partially purified A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) virus (ca. 74µgHA/ml) |
| Influenza antigen B/Brisbane/60/2008 | NIBSC | 13/234 | Inactivated, partially purified B/Brisbane/60/2008 virus (ca. 42µgHA/ml) |
| Influenza antigen B/Massachusetts/02/2012 | NIBSC | 13/134 | Inactivated, partially purified B/Massachusetts/02/2012 virus (ca. 35µgHA/ml) |
| Serum-Tubes | S-Monovette, Sardstedt | 01.1601.100 | For serum extraction with clotting activator |
| Single Donor Human RBC, Type 0 | Innovative Research | IPLA-WB3 | Suspension of single donor human red blood cells in Alsever's solution (ca. 26%) |
| Turkey RBC (10%) | Cedarlane | CLC1180 | 10% suspension of turkey red blood cells in Alsever's solution |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco |
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