Un'analisi di inibizione (HI) ottimizzato emagglutinazione per quantificare i titoli dell'anticorpo specifico dell'Influenza
Summary
I protocolli presentati viene descritto come eseguire un’analisi di inibizione di emagglutinazione per quantificare i titoli dell’anticorpo specifico dell’influenza da campioni di siero dei destinatari del vaccino di riossidazione. Il primo test determina concentrazioni di antigene virale ottimale di emagglutinazione. Il secondo test quantifica i titoli dell’anticorpo specifico dell’influenza di inibizione di emagglutinazione.
Abstract
I titoli dell’anticorpo sono comunemente usati come markers surrogati per sierologica protezione contro l’influenza e altri agenti patogeni. Per capire l’immunità indotta dal vaccino è necessaria una conoscenza dettagliata di produzione dell’anticorpo pre- e post-vaccinazione. Questo articolo descrive un protocollo affidabile punto per punto per determinare i titoli dell’anticorpo specifico dell’influenza. Il primo protocollo descrive un metodo per specificare la quantità di antigene necessarie per emagglutinazione, che standardizza le concentrazioni per successivo utilizzo nel secondo protocollo (analisi di emagglutinazione, HA dosaggio). Il secondo protocollo descrive la quantificazione dei titoli dell’anticorpo specifico dell’influenza contro diversi ceppi virali utilizzando una diluizione seriale di umana del siero o cella surnatanti (analisi di inibizione di emagglutinazione, test HI).
Come un esempio applicato, vi indichiamo la risposta dell’anticorpo di una coorte di sana, che ha ricevuto un vaccino dell’influenza trivalente inattivato. Inoltre, la cross-reattività tra il virus influenzali diversi è mostrata e metodi per minimizzare la reattività crociata utilizzando diversi tipi di animali globuli rossi (RBCs) sono spiegati. La discussione evidenzia vantaggi e svantaggi dei saggi presentati e come la determinazione dei titoli dell’anticorpo specifico dell’influenza può migliorare la comprensione dell’immunità correlate al vaccino.
Introduction
Infezione con virus dell’influenza è associata con considerevole morbosità, mortalità e costi sanitari elevati1,2,3,4. In particolare, anziani, neonati, donne incinte e pazienti con malattia cronica sono a rischio per i risultati clinici più gravi. Pertanto, la vaccinazione contro ceppi di virus influenzali in circolazione è la misura primaria per diminuire il carico di malattia in queste popolazioni ad alto rischio. L’aumento della risposta immunitaria individuale dopo vaccinazione, ad es., anticorpi specifici per l’influenza sopra una soglia protettiva, riduce il rischio individuale di infezione e in generale la probabilità di trasmissione virale all’interno di una popolazione 5. una conoscenza dettagliata del vaccino-indotta risposta immunitaria umorale in diverse popolazioni e tra vari gruppi di età è un elemento chiave per rispondere a quesiti clinici importanti6,7,8 , 9, come: perché alcuni pazienti anziani hanno infezioni malgrado la vaccinazione precedente? Che cosa è una “buona” e “sufficiente” protezione indotta dal vaccino? Quante volte un vaccino deve essere applicato a un paziente immunosuppressed per raggiungere i titoli protettivi? Qual è il dosaggio più efficace? Qual è l’impatto di un romanzo ausiliario su titoli dell’anticorpo dopo la vaccinazione? La misurazione della produzione dell’anticorpo specifico vaccino può aiutare a rispondere a queste domande importanti e migliorare i risultati di vaccinazione.
La quantificazione dei titoli dell’anticorpo del virus-specifici possa essere eseguita con vari metodi immunologici. Questo include fase solida10 o basati su tallone i dosaggi ELISA11 , HI test12e neutralizzante saggi13. Metodi basati su ELISA permettono lo screening di relativamente grandi quantità di campioni di siero contro vari antigeni. Inoltre, patogeno-specifiche dell’immunoglobulina (Ig) M e IgG possono essere esplorati separatamente. Anche se le caratteristiche di un antigene, per esempio, la sequenza lineare degli aminoacidi o delle particelle virus-simili possono influenzare il legame degli anticorpi, lo spettro di potenziali epitopi è molto ampio e non fornisce informazioni su se un anticorpo risposta ha rilevanza funzionale.
Al contrario, l’analisi di neutralizzazione determina il potenziale di anticorpi funzionalmente inibire l’infezione delle cellule e quindi riflette il potenziale di neutralizzazione. Tuttavia, questo metodo è molto laborioso, richiede la messa in coltura di specifiche linee cellulari e vivere virus, e pertanto, è che richiede tempo, costosa e richiede attrezzature speciali.
Questo articolo viene descritto un passo-passo la World Health Organization WHO-based HI protocollo12 per quantificare i titoli dell’anticorpo specifico dell’influenza. Emoagglutinazione è un effetto caratteristico di alcuni virus che porta l’agglutinazione degli eritrociti. L’inibizione di questo effetto con i sieri dei pazienti permette la misura delle concentrazioni di anticorpi inibitori, che riflette un effetto neutralizzante.
Abbiamo modificato il flusso di lavoro del WHO-protocollo per consentire una gestione più efficiente dei campioni multipli allo stesso tempo e riducendo il tempo necessario. Il primo protocollo descrive la determinazione del potenziale di un antigene particolare dell’influenza dell’agglutinazione. In tal modo, la concentrazione di antigene dell’influenza corretta è determinata per il secondo protocollo. Questa parte dovrebbe essere ripetuta con ogni nuovo antigene virale, come pure ogni batch di sangue.
Il secondo protocollo descrive la determinazione dei titoli dell’anticorpo specifico dell’influenza. I protocolli presentati sono ottimizzati per l’indagine del virus dell’influenza e campioni di siero umano tuttavia, può anche essere applicato per i campioni di siero del mouse o surnatanti di coltura cellulare da cellule immuni stimolate, per esempio, B-cellule virus-specifiche. Risultati possono essere determinati come assoluti misurati titoli. In molti studi di vaccino, i titoli di media geometrica e l’intervallo di confidenza del 95% sono indicati per ogni particolare popolazione. Per interpretazione, sieroprotezione o sieroconversione sono spesso utilizzati per descrivere la suscettibilità di una popolazione per un certo virus. Sieroprotezione è definita come un titolo di ≥ 1: 40 e sieroconversione come un titolo più di 4 volte aumentare con conseguimento di titoli di sieroprotettivi tra due intervalli di tempo (più comunemente utilizzati pre-vaccinazione e 30 giorni dopo la vaccinazione).
Entrambi i protocolli sono facili da usare e possono essere adattati ad una vasta gamma di domande di ricerca. In particolare, può essere utilizzati per determinare rapidamente e in modo affidabile i titoli dell’anticorpo contro vari altri virus con la capacità di emoagglutinazione, quali morbillo, polyomaviruses, parotite o rosolia14,15,16 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Quantificazione dei titoli di anticorpo specifico del virus dell’influenza di pre- e post-vaccinazione è uno strumento importante e necessario per gli studi di vaccino. Sulla base delle misure di surrogato di protezione contro l’infezione del virus, ad esempio di sieroprotezione (> 01:40) o sieroconversione (aumento di 4 volte del titolo), vaccinazione strategie possono essere ottimizzato9. Utilizzando i protocolli forniti può determinare: (i) il potenziale di emagglutinazione di un particolare …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
nessuno.
Materials
| 25 ml Disposable Multichannel Pipette Reservoirs | Integra | 4312 | |
| 8-well PCR tubes | Brand GMBH | 781332 | For serum aliquots |
| 96-well microtiter plate, U-shaped | TPP | 92097 | For HI assay when using mammalian RBCs |
| 96-well microtiter plate, V-shaped | Corning Costar | 3897 | For HI assay when using avian RBCs |
| Aqua ad iniect. Steril | Bichsel AG | 1000004 | For preparing influenza antigen and cholera filtrate solutions |
| Chicken RBC (10%) | Cedarlane | CLC8800 | 10% suspension of chicken red blood cells in Alsever's solution |
| Cholera filtrate | Sigma-Aldrich | C8772 | Used as receptor destroying enzyme (RDE) |
| Dulbecco's PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | For diluting the serum samples, RBCs and antigens |
| Eppendorf Multichannel pipette, 12-channel, 10-100 µl | Sigma-Aldrich | Z683949 | |
| Eppendorf Multichannel pipette, 8-channel, 10-100 µl | Sigma-Aldrich | Z683930 | |
| Guinea Pig RBC (10%) | Cedarlane | CLC1800 | 10% suspension of guinea pig red blood cells in Alsever's solution |
| Influenza Anti-A/California/7/09 HA serum | NIBSC | 14/134 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-A/Switzerland/9715293/2013-like HA serum | NIBSC | 14/272 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-A/Texas/50/2012-Like HA Serum | NIBSC | 13/178 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-B/Brisbane/60/2008-HA serum | NIBSC | 13/254 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-B/Massachusetts/02/2012 HA serum | NIBSC | 13/182 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza antigen A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) | NIBSC | 12/168 | Inactivated, partially purified A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) virus (ca. 46µgHA/ml) |
| Influenza antigen A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88) | NIBSC | 14/254 | Inactivated, partially purified A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88) virus (ca. 55µgHA/ml) |
| Influenza antigen A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) | NIBSC | 13/112 | Inactivated, partially purified A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) virus (ca. 74µgHA/ml) |
| Influenza antigen B/Brisbane/60/2008 | NIBSC | 13/234 | Inactivated, partially purified B/Brisbane/60/2008 virus (ca. 42µgHA/ml) |
| Influenza antigen B/Massachusetts/02/2012 | NIBSC | 13/134 | Inactivated, partially purified B/Massachusetts/02/2012 virus (ca. 35µgHA/ml) |
| Serum-Tubes | S-Monovette, Sardstedt | 01.1601.100 | For serum extraction with clotting activator |
| Single Donor Human RBC, Type 0 | Innovative Research | IPLA-WB3 | Suspension of single donor human red blood cells in Alsever's solution (ca. 26%) |
| Turkey RBC (10%) | Cedarlane | CLC1180 | 10% suspension of turkey red blood cells in Alsever's solution |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco |
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