Genom-brede kartlegging av protein-DNA-interaksjoner med ChEC-seq i<em> Saccharomyces cerevisiae</em

Summary

Vi beskriver kromatin endogen klyvning kombinert med høy gjennomstrømningssekvensering (ChEC-seq), en kromatinimmunpresipitasjon (ChIP) -orthogonal metode for kartlegging av proteinbindingssteder som er genomspredte med mikrokocukleuklease (MNase) fusjonsproteiner.

Abstract

Genomfattende kartlegging av protein-DNA-interaksjoner er kritisk for forståelse av genregulering, kromatin-remodeling og andre kromatin-residente prosesser. Formaldehyd-tverrbinding etterfulgt av kromatinimmunutfelling og høy gjennomstrømningssekvensering (X-ChIP-seq) har blitt brukt til å få mange verdifulle innsikter i genombiologi. Imidlertid har X-ChIP-seq bemerkelsesverdige begrensninger knyttet til kryssbinding og sonikering. Native ChIP unngår disse ulempene ved å utelate kryssbinding, men resulterer ofte i dårlig gjenoppretting av kromatinbundne proteiner. I tillegg er alle ChIP-baserte metoder underlagt antistoffkvalitetshensyn. Enzymatiske metoder for kartlegging av protein-DNA-interaksjoner, som involverer fusjon av et protein av interesse for et DNA-modifiserende enzym, har også blitt brukt til å kartlegge protein-DNA-interaksjoner. Vi har nylig kombinert en slik metode, kromatin endogen spaltning (ChEC), med høy gjennomstrømningssekvensering som ChEC-seq. ChEC-seq er avhengig av fusjon av en kromatin-assocIat protein av interesse for mikrokocellnuklease (MNase) for å generere målrettet DNA-spaltning i nærvær av kalsium i levende celler. ChEC-seq er ikke basert på immunutfelling, og omgår så potensielle problemer med tverrbinding, sonikering, kromatinoppløseliggjøring og antistoffkvalitet samtidig som det gir kort oppløsning med minimalt bakgrunnssignal. Vi ser på at ChEC-seq vil være en kraftig motstykke til ChIP, og gir et selvstendig middel til å både validere ChIP-seq-funn og oppdage ny innsikt i genomisk regulering.

Introduction

Kartlegging av bindingssteder for transkripsjonsfaktorer (TFs), kromatinomformere og andre kromatinassosierte regulatoriske faktorer er nøkkelen til å forstå alle kromatinbaserte prosesser. Mens kromatinimmunpresipitasjon og høy gjennomstrømningssekvensering (ChIP-seq) tilnærminger har blitt brukt til å få mange viktige innsikt i genombiologi, har de bemerkelsesverdige begrensninger. Vi har nylig introdusert en alternativ metode, kalt kromatin endogen spaltning og høy gjennomstrømningssekvensering (ChEC-seq) ¹ , for å omgå disse ulempene.

ChIP-seq utføres oftest med et innledende formaldehydforbindelsestrinn (X-ChIP-seq) for å bevare protein-DNA-interaksjoner. Imidlertid har en rekke nyere studier indikert at X-ChIP-seq fanger transient eller ikke-spesifikk protein-DNA-interaksjoner ^{2 , 3 , 4 , 5} <Sup>, ^{6 , 7 , 8} , som gir opphav til falske positive bindingssteder. I tillegg er sonikering, som vanligvis brukes til fragmentering av kromatin i X-ChIP-seq-eksperimenter, fortrinnsvis sakreområder av åpen kromatin, som fører til forspenet gjenvinning av fragmenter fra disse regionene ^{9 , 10} . Sonikering gir også en heterogen blanding av fragmentlengder, til slutt begrensende bindingsstedoppløsning, selv om tilsetningen av et eksonuklease-fordøyelsestrinn kan forbedre resolusjonen ^{11 , 12 i} stor grad. Native ChIP-metoder som okkuperte regioner av genomer fra affinitetsrenset, naturlig isolert kromatin (ORGANISK) ¹³ bruker ikke tverrbinding og fragmentkromatin med mikrokocellnuklease (MNase), lindrer potensielle forstyrrelser assosiert med formaldehyd-tverrbinding og sonikering. Derimot,Løseligheten av mange kromatinbundne proteiner under de forholdsvis milde forhold som kreves for naturlig kromatinekstraksjon er dårlig, som potensielt fører til redusert dynamisk område og / eller falske negativer ¹⁴ .

Mens forskjellige iterasjoner av ChIP-seq er mest brukte for genomgående kartlegging av protein-DNA-interaksjoner, har også flere kartleggingsteknikker basert på fusjon av proteiner av interesse for forskjellige DNA-modifiserende enzymer blitt implementert. En slik tilnærming er DNA-adeninmetyltransferaseidentifikasjon (DamID) ¹⁵ , hvor et kromatinbindende protein av interesse er genetisk fusjonert til Dam, og denne fusjon uttrykkes i celler eller dyr, hvilket resulterer i metylering av GATC-sekvenser nærliggende for bindingssteder for proteinet. DamID er fordelaktig ved at den ikke stole på immunutfelling, og unngår således kryssbinding, antistoffer eller kromatinsolubilisering. Det utføres også in vivo . derimot, Er oppløsningen av DamID begrenset til kilobaseskalaen og metyleringsaktiviteten til Dam-fusjonsproteinet er konstitutiv. En andre metode basert på enzymatisk fusjon er Calling Card-seq ¹⁶ , som benytter fusjon av en faktor av interesse for en transposase, som dirigerer stedspesifikk integrering av transposoner. Som DamID er Calling Card-seq ikke basert på immunutfelling, og har dermed lignende fordeler, med den ekstra fordelen av økt oppløsning. Imidlertid kan Calling Card-seq være begrenset av sekvensbiaser av transposaser og er også avhengig av nærvær av restriksjonssteder nær transposoninnføringssteder.

En tredje enzymatisk fusjonsmetode, utviklet i Laemmli lab, er kromatin endogen spaltning (ChEC) ¹⁷ . I ChEC uttrykkes en fusjon mellom et kromatinassosiert protein og MNase i celler, og ved kalsiumtilsetning for å aktivere MNase spaltes DNA proksimalt til bindingssteder for merketFaktor ( figur 1 ). I forbindelse med Southern Blotting har ChEC blitt brukt til å karakterisere kromatinstruktur og proteinbinding ved et antall individuelle loci i gjær ^{17 , 18} , og har blitt kombinert med lavoppløselig mikroarrayanalyse for å undersøke samspillet mellom nukleære pore-komponenter med gjæren Genom ¹⁹ . ChEC tilbyr fordeler som ligner på DamID og Calling Card-seq, og oppløsningen er nesten single-base pair når den analyseres av primer forlengelse ¹⁹ . ChEC er også kontrollerbar: Robust DNA-spaltning ved MNase avhenger av tilsetning av millimolar kalsium, slik at MNase er inaktiv ved lave, lave kalsiumkonsentrasjoner observert i levende gjærceller ²⁰ .

Tidligere postulerte vi at kombinere ChEC med høy gjennomstrømningssekvensering (ChEC-seq) ville gi kart med høy oppløsning på TF-bindingssteder. Faktisk, ChEC-seq genererte kart med høy oppløsning av de spirende gjær generelle regulatoriske faktorene (GRF) Abf1, Rap1 og Reb1 over genomet ¹ . Vi har også brukt ChEC-seq med suksess på det modulære Mediator-komplekset, en konservert, essensiell global transkriptionell coaktivator ²¹ , som utvider bruken av ChEC-seq til megadalton-størrelse-komplekser som ikke direkte kontakter DNA og kan være vanskelig å kartlegge ved ChIP- Baserte metoder. ChEC-seq er en kraftig metode både for uavhengig validering av ChIP-seq-resultater og generering av ny innsikt i reguleringen av kromatin-residente prosesser. Her presenterer vi en trinnvis protokoll for implementering av denne metoden i spirende gjær.

Protocol

1. Generering av gjærstammer Generer en gjærstamme som bærer faktoren av interesse merket med MNase. PCR amplifiser MNase-merkekassetten fra den ønskede vektoren ( tabell 1 ) ved å bruke den spesifiserte reaksjonsblandingen ( tabell 2 ) og syklusbetingelsene ( tabell 3 ). Bland 5 μL av PCR-reaksjonen og 1 μl 6X DNA-fargestoff. Kjør hver PCR-alikvot på en 0,8% agarosegel ved 120 V i 40 minutter. Den forventede produktstørrel…

Representative Results

I tilfelle av et vellykket ChEC-eksperiment vil analyse av DNA ved agarosegelelektroforese avsløre en kalsiumavhengig økning i DNA-fragmentering over tid, som indikert ved smøring og eventuelt fullstendig fordøyelse av genomisk DNA. I noen tilfeller observeres en stige av bånd som ligner den som er sett med en tradisjonell MNase-fordøyelse etter utvidet fordøyelse. Dette er tilfelle for ChEC analyse av Reb1, en generell regulatorisk faktor som binder nukleosomutarmede regioner (ND…

Discussion

Vi har vist at ChEC kan kartlegge ulike klasser av gjærproteiner på kromatin, og forutse at den vil være bredt anvendelig for forskjellige familier av TF og andre kromatinbindende faktorer i gjær. ChEC-seq er fordelaktig ved at den ikke krever tverrbinding, kromatinsolubilisering eller antistoffer. Således unngår ChEC artefakter som er potensielt tilstede i X-ChIP-seq, slik som hyper-ChIPable artefact ^{3 , 4} og native ChIP, slik som falske negativer på gru…

Materials

dNTPs	NEB	N0447
Q5 high-fidelity DNA polymerase	NEB	M0491L	Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification.
TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder	ThermoFisher Scientific	10488085
Taq DNA polymerase	NEB	M0273L
cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	11836170001	It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit Mnase cleavage by chelation of Ca2+.
PMSF	ACROS Organics	AC215740010
Digitonin, High Purity	EMD Millipore	300410-250MG	Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing.
Proteinase K, 20 mg/mL	Invitrogen	25530049
RNase A, 10 mg/mL	ThermoFisher Scientific	EN0531
Ampure XP beads	Beckman Coulter	A63880	Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24).
MagneSphere magnetic rack	Promega	Z5342