ميكروفلويديك تدفق التدفق الخلوي بواسطة غير المتماثلة الكشف الوقت تمتد المجهر الضوئي (أتوم)
Summary
يصف هذا البروتوكول تنفيذ غير المتماثلة الكشف عن الوقت المجهر نظام المجهر الضوئي لتصوير خلية واحدة في تدفق فائق السرعة ميكروفلويديك وتطبيقاتها في التصوير التدفق الخلوي.
Abstract
وقد كان التوسع في عدد المعلمات القابلة للقياس، والذي يسمح لتحليل البيانات متعددة الأبعاد وبالتالي النتائج الإحصائية أعلى الثقة، والاتجاه الرئيسي في التطور المتقدم للتدفق الخلوي. ومن الجدير بالذكر أن إضافة قدرات التصوير عالية الدقة يسمح للتحليل المورفولوجي المعقدة للهياكل الخلوية / الفرعية الخلوية. هذا غير ممكن مع مقياس التدفق الخلوي القياسي. ومع ذلك، فإنه من المهم للنهوض معرفتنا الوظائف الخلوية ويمكن أن تستفيد البحوث علوم الحياة والتشخيص السريري، والرصد البيئي. دمج قدرات التصوير في التدفق الخلوي يضعف إنتاجية الفحص، ويرجع ذلك أساسا إلى القيود على السرعة والحساسية في تقنيات الكاميرا. للتغلب على هذه السرعة أو تحديا الإنتاجية التي تواجه التصوير الخلوي التدفق الخلوي مع الحفاظ على جودة الصورة، وقد أثبتت عدم المتماثلة الكشف عن امتداد المجهر الضوئي (أتوم) لتمكين عالية التباين، صورة خلية واحدةمع دقة فرعية الخلوية، في إنتاجية التصوير تصل إلى 100،000 الخلايا / ثانية. واستنادا إلى مفهوم التصوير للتصوير التقليدي الممتد عبر الزمن، والذي يعتمد على ترميز الصور البصري واسترجاعها من خلال استخدام نبضات ليزر عريضة النطاق فائقة السرعة، فإن أتوم تزيد من أداء التصوير من خلال تعزيز تباين الصورة للخلايا غير الملوثة / غير الملوثة. ويتحقق ذلك عن طريق النفاذ إلى معلومات تدرج الطور للخلايا، التي يتم تشفيرها طيفيا في نبضات ذات نطاق عريض واحد. وبالتالي، أتوم مفيد بشكل خاص في القياسات الإنتاجية العالية من التشكل وحيدة الخلية والملمس – معلومات تدل على أنواع الخلايا، والوظائف، وحتى وظائف. في نهاية المطاف، وهذا يمكن أن تصبح قوية التدفق التدفق الخلوي منصة للفينوتيبينغ الفيزيائية الحيوية من الخلايا، واستكمال الحالية للدولة من بين الفن مقايسة الخلوية البيوكيميائية القائم على علامة. يصف هذا العمل بروتوكول لإنشاء الوحدات الرئيسية لنظام أتوم (من الواجهة البصرية إلى البيانات pروسيسينغ والتصور الخلفية)، فضلا عن سير العمل من التدفق التدفق الخلوي على أساس أتوم، وذلك باستخدام الخلايا البشرية والطحالب الصغيرة على سبيل المثال.
Introduction
التصوير البصري يقدم أداة قوية والفحص القائم على الخلية ل (تقريبا) غير الغازية تصور التوزيع المكاني المفصل للعديد من المكونات الخلوية / تحت الخلوية، وبالتالي كشف العديد من التوقيعات المورفولوجية والبيوفيزيائية، والحيوية الجزيئية للخلايا. ومع ذلك، فإن هذه القدرة على استخراج معلومات عالية المحتوى من خلايا واحدة قد تعرضت للخطر عموما عندما كان عدد كبير من السكان وغير متجانسة من الخلايا يجب التحقيق. ويمثل هذا مفاضلة مشتركة في المقايسات القائمة على الخلية بين الإنتاجية القياس والمحتوى. ومن الأمثلة البارزة على ذلك أن إضافة القدرة على التصوير لتدفق الخلوي أدى إلى انخفاض حجم الانتاجية من قبل ما لا يقل عن 1-2 أوامر من حجم بالمقارنة مع أن التقليدية غير التصوير التدفق الخلوي. على الرغم من أنه يمكن أن توفر معقدة التحليل الخلايا واحدة المورفولوجية التي لا يمكن مع أجهزة قياس التدفق الخلوي القياسية 1 ، التصوير الخلوي التدفق الخلوي يفتقر عموما الإنتاجية الكافية لمعرفتباين التغاير الخلوي مع الثقة الإحصائية العالية. وهذا ضروري للاكتشافات الجديدة في علم الأحياء وللفهم التسبب في الأمراض. ويكمن التحدي التقني الرئيسي في الحد الأقصى للسرعة المتأصل الذي تفرضه استراتيجيات التصوير البصري المشتركة: مسح شعاع الليزر (على سبيل المثال، بواسطة مرايا غلفانومترية) و / أو أجهزة استشعار الصور (على سبيل المثال، الجهاز المقترن بالشحن (كسد) أكسيد أشباه الموصلات (كموس)). إن سرعة المسح الضوئي بالليزر مقيدة جوهريا بفعل الجمود الميكانيكي لمرايا المسح الضوئي، في حين أن معدل إطار كسد أو كموس محدود بالمقايضة الأساسية بين سرعة التصوير والحساسية ( أي أن زيادة معدل الإطار يؤدي إلى انخفاض حساسية الكشف عن الإشارة ، والعكس بالعكس).
واستنادا إلى كل البصرية، فائق السرعة آلية ترميز الصورة، وقد ثبت البصرية التصوير تمتد تمتد كمنصة جذابة لانتاج عالية تدفق تدفق الخلايامتر، دون الحاجة إلى أجهزة الاستشعار الصورة التقليدية أو المسح الضوئي الميكانيكي ليزر 2 ، 3 . ويمكن الاطلاع على الوصف التفصيلي لمبدأ العمل من الوقت تمتد التصوير في المراجع 4 ، 5 ، 6 ، 7 . وباختصار، تتكون من خطوتين لرسم الخرائط القابلة للتبديل: (1) التشفير الطيفي (رسم خرائط الطول الموجي)، حيث يتم تعيين إحداثيات مكانية للعينة المصورة إلى أطوال موجية مختلفة عبر طيف الحزمة النبضية النابضة 8 ، 9 ، و (إي) تحول فورييه التشتت (رسم الخرائط الطول الموجي) 9 ، حيث يتم تحويل مكونات الطول الموجي من نبضات الليزر الفردية (امتدت) عن طريق تشتت سرعة المجموعة (غفد) إلى الموجي (موجة الطول اجتاحت) الموجي ( الشكل 1 ). مهمسمة من سمات التصوير الوقت تمتد هو التضخيم البصري، الذي يلعب دورا حاسما في مكافحة فقدان حساسية بسبب فوتوديتكتيون فائق الوضوح وفقدان غفد، وبالتالي تعزيز نسبة إشارة إلى الضوضاء الصورة (شنر) دون أن تكون ملوثة ضوضاء فوتوديتكتور 9 . وبما أن كل نبضة ليزر تشفر خطا مسحيا للعينة المصورة، وهي متعامدة لتدفق أحادي الاتجاه للخلايا، فإن معدل مسح الخط الفعال يحدده معدل تكرار الليزر، الذي يتجاوز عادة مهز 10. هذه العملية فائق السرعة تمكن خالية من الضبابية، التقاط صورة خلية واحدة في الإنتاجية من 10،000-100،000 خلية / ثانية ( أي 10-100 مرات أعلى من التصوير الخلوي التدفق الخلوي التقليدي). ونتيجة لذلك، يمكن أن التصوير التصوير على نطاق زمني العثور على تطبيقات فريدة من نوعها في الإنتاجية العالية، خلية واحدة، والفحص القائم على الصورة، وخاصة عندما تكون هناك حاجة لتحديد عدم التجانس غير معروف أو خلايا نادرة / شاذة ضمن عدد كبير من السكان (الآلاف إلى الملايين من سل لس)، مثل نادرة فحص الخلايا السرطانية 10 أو الصغرى الطحالب تصنيف 11 .
ويعتمد التصوير الممتد زمنيا في الغالب على التقاط صورة مشرقة (بف)، يتم من خلالها تباين الصورة من خلال تشتت الضوء وامتصاصه من الخلايا 2 ، 3 ، 9 ، 10 ، 11 . هذه القدرات خالية من التسمية، خلية واحدة التصوير يمكن أن تتجاوز الآثار الضارة المرتبطة تسميات الفلورسنت، مثل السمية الخلوية و فوتوبلاشينغ، وبعد تقديم معلومات قيمة لتحليل خلية واحدة على أساس الخلوية وشبه الخلوية الملمس والتشكل. وقد أثبتت هذه المعلمات خالية من التسمية لتكون فعالة لتصنيف صورة عميقة من الخلايا، وخصوصا عندما يكون عدد السكان خلية هائلة متاح 11 ،"كريف"> 12. ومع ذلك، في كثير من المناسبات، يفشل التصوير بف لتوفير تباين كاف للكشف عن مورفولوجيا مفصلة من الخلايا الشفافة خالية من التسمية. وقد وضعت طرائق مختلفة خالية من التسمية، وعلى النقيض من المرحلة، وتمتد الوقت لتعزيز التصوير النقيض من معدلات الإطار فائق السرعة 13 ، 14 ، 15 . ومن بين هذه التقنيات، تم تطوير المجهر الضوئي الذي يمتد زمنيا غير متناظرة (أتوم) للكشف عن التباين التفاضلي (التباين التفاضلي – التباين – ديك) على أساس مفهوم مشابه لتصوير سليرن، مجانا، وارتفاع التباين التصوير من خلايا واحدة في سرعة ميكروفلويديك فائقة (تصل إلى 10 م / ث) 16 . ويمكن توليد هذا التأثير بسهولة من خلال الكشف المائل أو الإضاءة عن طريق عرقلة مسار الحزمة المشفرة بالصورة جزئيا أو إمالة الشعاع قبل الكشف الضوئي. ميزة أخرى من أتوم هو أالقدرة على الحصول في وقت واحد على اثنين من التناقضات التدرج المرحلة على طول التوجهات المعاكسة. ويؤدي الطرح الكثيف والجمع بين صورتين متعاكستين عكس التباين التفاضلي لمرحلة التدرج والتباين الامتصاصي، على التوالي، من نفس خط المسح الضوئي. يقدم هذا العمل بروتوكول مفصل يصف تنفيذ أتوم، بما في ذلك إنشاء الإعداد البصري، وإعداد العينة، والحصول على البيانات والتصور. على وجه التحديد، هذا العمل يدل على عملية أتوم مع التصوير خلية واحدة من خلايا الدم البشرية، والخلايا السرطانية، والعوالق النباتية (الطحالب الدقيقة). وهذا يسلط الضوء على تطبيق أتوم لتصوير التدفق الخلوي، وليس فقط في الساحة الطبية الحيوية، ولكن أيضا في البحوث البحرية والوقود الحيوي 17 ، 18 .
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك العديد من التفاصيل الفنية التي تتطلب اهتماما خاصا أثناء إعداد نظام أتوم. أولا، من الضروري أن نلاحظ أن الإضاءة غير المتماثلة / المائلة الطيفية مشفرة يمكن أن تدخل مكونات التدرج المرحلة المتبقية ( أي تأثير التظليل) في التباين الامتصاص والتأثير على تعزيز التبا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر السيد ب. يونغ لإعداد مسف-7 بالنسبة لنا. وقد حظي هذا العمل بدعم جزئي من المنح المقدمة من مجلس منح البحوث لمنطقة هونغ كونغ الإدارية الخاصة في الصين (مشروع رقم 17259316 و 17207715 و 17207714 و 17205215 و هكو 720112E) وبرنامج دعم الابتكار والتكنولوجيا إيتس / 090/14 )، وصندوق تنمية الجامعة من جامعة هونج كونج.
Materials
| Nikon Plan Fluorite Physiology Objectives 40X | Nikon | MRF07420 | Objective lens (Obj2) |
| Olympus Plan Fluorite Objective, 0.75 NA, 0.51 mm WD, 40X | Olympus | RMS40X-PF | Objective lens (Obj1) |
| N-BK7 Plano-Convex Lenses | Thorlabs | LA1145-C | For relaying spectral shower |
| FC/APC Fiber Collimation Package | Thorlabs | F220APC-1064 | For outputing and collecting laser pulses |
| Pellicle beamsplitter | Thorlabs | BP145B3 | For making beam replica |
| Protected silver mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | For reflecting light |
| 800-1650nm 12GHz single mode DC-coupled NIR Photoreceiver | Newport | 1544-B | For converting light into electrical signal |
| Infiniium High-Performance Oscilloscope | Agilent | DSOX91604A | To save the light-converted electrical signals |
| HI1060 optical fiber | Corning | HI1060 | Optical fiber for time-stretch |
| YTTERBIUM DOPED FIBER AMPLIFIER | Keopsys | KPS-STD-BT-YFA-37-BO-SM-111-FA-FA | Optical in-line amplifier |
| Holographic grating | Wasatch Photonics | 020305-6 | Grating |
| Infuse/Withdraw Syringe Pumps | Harvard Apparatus | PHD 2000 | Syringe pump for sample loading in micro-fluidic channels |
References
- Lau, A. K. S., Wong, T. T. W., Shum, H. C., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K., Barteneva, N. S., Vorobjev, I. A. . Imaging Flow Cytometry: Methods and Protocols. , 23-45 (2016).
- Goda, K., Tsia, K. K., Jalali, B. Serial time-encoded amplified imaging for real-time observation of fast dynamic phenomena. Nature. 458 (7242), 1145-1149 (2009).
- Goda, K., Jalali, B. Dispersive Fourier transformation for fast continuous single-shot measurements. Nat Photon. 7 (2), 102-112 (2013).
- Lau, A. K., Shum, H. C., Wong, K. K., Tsia, K. K. Optofluidic time-stretch imaging – an emerging tool for high-throughput imaging flow cytometry. Lab Chip. 16 (10), 1743-1756 (2016).
- Lau, A. K. S., Tang, A. H. L., Xu, J., Wong, X. W., Y, K. K., Tsia, K. K. Optical Time Stretch for High-Speed and High-Throughput Imaging – From Single-Cell to Tissue-Wide Scales. IEEE J. Sel. Top. in Quant. Electron. 22 (4), (2016).
- Lei, C., Guo, B., Cheng, Z., Goda, K. Optical time-stretch imaging: Principles and applications. Appl Phys Rev. 3 (1), 011102 (2016).
- Lei, C., Guo, B., Cheng, Z., Goda, K. Optical time-stretch imaging: Principles and applications. Applied Physics Reviews. 3 (011102), (2016).
- Goda, K., et al. High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (29), 11630-11635 (2012).
- Goda, K., Solli, D. R., Tsia, K. K., Jalali, B. Theory of amplified dispersive Fourier transformation. Physical Review A. 80 (4), 043821 (2009).
- Goda, K., et al. High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (29), 11630-11635 (2012).
- Lai, Q. T. K., et al. High-throughput time-stretch imaging flow cytometry for multi-class classification of phytoplankton. Opt. Express. 24 (25), 28170-28184 (2016).
- Chen, C. L., et al. Deep Learning in Label-free Cell Classification. Sci Rep. 6, 21471 (2016).
- Fard, A. M., et al. Nomarski serial time-encoded amplified microscopy for high-speed contrast-enhanced imaging of transparent media. Biomed Opt Express. 2 (12), 3387-3392 (2011).
- Lau, A. K., et al. Interferometric time-stretch microscopy for ultrafast quantitative cellular and tissue imaging at 1 mum. J Biomed Opt. 19 (7), 76001 (2014).
- Mahjoubfar, A., Chen, C., Niazi, K. R., Rabizadeh, S., Jalali, B. Label-free high-throughput cell screening in flow. Biomed Opt Express. 4 (9), 1618-1625 (2013).
- Wong, T. T., et al. Asymmetric-detection time-stretch optical microscopy (ATOM) for ultrafast high-contrast cellular imaging in flow. Sci Rep. 4, 3656 (2014).
- Mata, T. M., Martins, A. A., Caetano, N. S. Microalgae for biodiesel production and other applications: A review. Renew Sustainable Energy Rev. 14 (1), 217-232 (2010).
- Irigoien, X., Huisman, J., Harris, R. P. Global biodiversity patterns of marine phytoplankton and zooplankton. Nature. 429 (6994), 863-867 (2004).
- Wei, X., et al. Coherent Laser Source for High Frame-Rate Optical Time-Stretch Microscopy at 1.0 µm. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 20 (5), 384-389 (2014).
- Wei, X., et al. Breathing laser as an inertia-free swept source for high-quality ultrafast optical bioimaging. Opt. Lett. 39 (23), 6593-6596 (2014).
- Xu, Y., Wei, X., Ren, Z., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. Ultrafast measurements of optical spectral coherence by single-shot time-stretch interferometry. Sci Rep. 6, 27937 (2016).
- Tsia, K. K., Goda, K., Capewell, D., Jalali, B. Performance of serial time-encoded amplified microscope. Opt. Express. 18 (10), 10016-10028 (2010).
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Challenges in circulating tumour cell research. Nat Rev Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).
- Kling, J. Beyond counting tumor cells. Nat Biotech. 30 (7), 578-580 (2012).
- Hodgkinson, C. L., et al. Tumorigenicity and genetic profiling of circulating tumor cells in small-cell lung cancer. Nat Med. 20 (8), 897-903 (2014).
- Ozkumur, E., et al. Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells. Sci Transl Med. 5 (179), (2013).
- Hou, H. W., et al. Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces. Scientific Reports. 3, 1259 (2013).
- Karabacak, N. M., et al. marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples. Nat. Protocols. 9 (3), 694-710 (2014).
- Krebs, M. G., et al. Molecular analysis of circulating tumour cells-biology and biomarkers. Nat Rev Clin Oncol. 11 (3), 129-144 (2014).
- Wu, J., et al. Ultrafast Laser-Scanning Time-Stretch Imaging at Visible Wavelengths. Light Sci Appl. , (2016).
