Mikrofluidisk Imaging Flödescytometri genom Asymmetrisk Detektering Tidssträckning Optisk Mikroskopi (ATOM)
Summary
Detta protokoll beskriver genomförandet av ett asymmetriskt detekterings-tidsträckningsoptiskt mikroskopysystem för enkelcellsavbildning i ultrasnabbt mikrofluidiskt flöde och dess tillämpningar i bildningsflödescytometri.
Abstract
Att skala antalet mätbara parametrar, vilket möjliggör multidimensionell dataanalys och därmed högre statistikresultat, har varit den främsta trenden i den avancerade utvecklingen av flödescytometri. Att lägga till högupplösta avbildningskapacitet möjliggör särskilt den komplexa morfologiska analysen av cellulära / subcellulära strukturer. Detta är inte möjligt med standardflödescytometrar. Det är dock värdefullt för att främja vår kunskap om cellulära funktioner och kan gynna biovetenskaplig forskning, klinisk diagnostik och miljöövervakning. Att integrera bildbehandlingskapacitet i flödescytometri komprometterar analysens genomströmning, främst på grund av begränsningarna av hastighet och känslighet i kameratekniken. För att övervinna denna hastighet eller genomströmningsutmaning mot bildbehandlingsflödescytometri, samtidigt som bildkvaliteten bevaras, har asymmetrisk detektering tidsoptisk optisk mikroskopi (ATOM) visats för att möjliggöra en kontrast med enstaka cellerIngående med subcellulär upplösning vid en avbildningströmsnivå så hög som 100 000 celler / s. Baserat på bildkonceptet för konventionell tidsträckningsavbildning, som bygger på all-optisk bildkodning och -hämtning genom användning av ultrasnabba bredbandspulser, förbättrar ATOM vidare bildhantering genom att förbättra bildkontrasten hos omärkta / obestämda celler. Detta uppnås genom att få tillgång till fas-gradientinformationen hos cellerna, som är spektralkodad till single-shot bredbandspulser. Därför är ATOM särskilt fördelaktigt vid mätningar med hög genomströmning av encells morfologi och struktur – information som indikerar celltyper, tillstånd och jämna funktioner. I slutändan kan detta bli en kraftfull bildningsflödescytometriplattform för biofysisk fenotypning av celler, som kompletterar den nuvarande toppmoderna biokemiska markörbaserade cellulära analysen. I det här arbetet beskrivs ett protokoll för att fastställa nyckelmodulerna i ett ATOM-system (från optisk frontänd till data pRocessing och visualiseringsbackend), liksom arbetsflödet av bildningsflödescytometri baserat på ATOM, med användning av humana celler och mikroalger som exemplen.
Introduction
Optisk bildbehandling presenterar ett kraftfullt verktyg och en cellbaserad analys för att (nästan) icke-invasivt visualisera den detaljerade rumsliga fördelningen av många cellulära / subcellulära komponenter, vilket avslöjar en mängd morfologiska, biofysiska och biomolekylära signaturer av celler. Denna förmåga att extrahera höghaltig information från enskilda celler har emellertid generellt äventyras när en enorm och heterogen population av celler skulle undersökas. Detta markerar en gemensam avvägning i cellbaserade analyser mellan mätningens genomströmning och innehåll. Ett anmärkningsvärt exempel är att tillsats av bildningsförmåga för att flyta cytometri har resulterat i en nedskalning av genomströmning med minst 1-2 storleksordningar jämfört med den för de klassiska icke-bildande flödescytometrarna. Även om det kunde erbjuda komplex morfologisk enkelcellsanalys som inte är möjlig med standardflödescytometrar 1 saknar bildbildningsflödescytometrin i allmänhet tillräcklig genomströmning till idFöranleder cellulär heterogenitet med högt statistiskt förtroende. Detta är nödvändigt för nya upptäckter i biologi och för att få en förståelse för patogenesen av sjukdomar. Den viktigaste tekniska utmaningen ligger i den inneboende hastighetsbegränsning som införs av de gemensamma optiska bildstrategierna: laserstråleskanning ( t.ex. av galvanometriska speglar) och / eller bildsensorer ( t.ex. laddkopplad enhet (CCD) och komplementära metall- Oxidhalvledare (CMOS)). Laserscanningshastigheten begränsas i grunden av skanningsspeglarnas mekaniska inerti, medan ramhastigheten för CCD eller CMOS är begränsad av den grundläggande avvägningen mellan bildhastighet och känslighet ( dvs ökar ramhastighetsledarna till minskad signaldetekteringskänslighet , och vice versa).
Baserat på en all-optisk, ultrasnabb bildkodningsmekanism har optisk tidsträckningsavbildning visat sig som en attraktiv plattform för hög genomströmningsbildningsflödescytOmeters, utan behov av konventionella bildsensorer eller mekanisk laserskanning 2 , 3 . Detaljerade beskrivningar av arbetsprincipen för tidsträckningsavbildning finns i referenser 4 , 5 , 6 , 7 . Kortfattat består den av två utbytbara mappningssteg: (i) spektralkodning (våglängdsutrymme-kartläggning), där rums-koordinaterna för det avbildade provet kartläggs till olika våglängder över spektralen hos den ljuspulserade strålen 8 , 9 , Och (ii) en dispersiv Fourier-transformation (våglängdstidskartläggning) 9 , i vilken våglängdskomponenterna hos individuella laserpulser transformeras (sträckas) via grupphastighetsdispersion (GVD) i temporära vågformade vågformar ( Figur 1 ). En viktigFunktionen av tidsträckningsavbildning är optisk förstärkning som spelar en viktig roll för att bekämpa förlusten av känslighet på grund av ultrasnabb fotodetektion och GVD-förlust, vilket förbättrar bildens signal-brusförhållande (SNR) utan att vara förorenad av fotodetektorens brus 9 . Eftersom varje laserpuls kodar för en linjeskanning av det avbildade provet, vilket är ortogonalt för det enriktade flödet av cellerna, bestäms en effektiv linjeskanningshastighet av laserrepetitionshastigheten, vilken typiskt är bortom 10 MHz. Denna ultrasnabba operation möjliggör oskarp bildtagning av enstaka celler med en genomströmning av 10 000-100 000 celler / s ( dvs 10-100 gånger högre än konventionell bildbehandlingsflödescytometri). Som ett resultat kunde tidsträckningsavbildning hitta unika tillämpningar i hög genomströmning, encells, bildbaserad screening, särskilt när det är nödvändigt att identifiera okänd heterogenitet eller sällsynta / avvikande celler inom en stor population (tusentals miljoner cel Ls), såsom sällsynt cancercellscreening 10 eller mikroalgerklassificering 11 .
Tidsträckningsavbildning beror främst på bildfångning med ljusfält (BF), från vilken bildkontrast genereras genom ljusspridning och absorption från cellerna 2 , 3 , 9 , 10 , 11 . Sådana etikettfria, encellsavbildande förmågor kan kringgå de skadliga effekterna associerade med fluorescerande etiketter, såsom cytotoxicitet och fotobildning, och ändå tillhandahålla värdefull information för enkelcellsanalys baserad på cellulär och subcellulär struktur och morfologi. Dessa etikettfria parametrar har visat sig vara effektiva för djupbildsklassificering av celler, speciellt när en enorm cellpopulation är tillgänglig 11 ,"Xref"> 12. Men vid många tillfällen misslyckas BF-bildbehandling med tillräcklig kontrast för att avslöja den detaljerade morfologin hos de etikettfria transparenta cellerna. Olika etikettfria, faskontrast-, tidssträckta bildhanteringsmodaliteter har utvecklats för att förbättra bildkonstanten vid ultrasnabb ramhastighet 13 , 14 , 15 . Bland dessa tekniker utvecklades asymmetrisk detekterings-tidsträckningsoptisk mikroskopi (ATOM) för att avslöja fas-gradienten (differential-interferens-kontrast- (DIC) -liknande) kontrast baserad på ett koncept som liknar Schlieren-fotografering, vilket möjliggör etikett- Fri, hög kontrast avbildning av enskilda celler vid en ultrahög mikrofluidisk hastighet (upp till 10 m / s) 16 . Denna effekt kan lätt genereras genom sned detektion eller belysning genom att delvis blockera den bildkodade strålbanan eller luta strålen före fotodetektion. En annan fördel med ATOM är dess aFörmåga att samtidigt förvärva två fas-gradientkontraster längs motsatta orienteringar. Intensitetssubtraktion och summering av två motsatta kontrastbilder ger differensfas-gradientkontrast respektive absorptionskontrast från samma linjescanning. Detta arbete presenterar ett detaljerat protokoll som beskriver implementeringen av ATOM, inklusive upprättandet av den optiska installationen, provberedningen och datainsamling och visualisering. Specifikt demonstrerar detta arbete ATOM-operationen med encellsavbildning av humana blodceller, cancerceller och fytoplankton (mikroalger). Detta belyser ATOMs tillämplighet på bildbehandling av flödescytometri, inte bara inom den biomedicinska arenan utan även i marin och biobränsleforskning 17 , 18 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns flera tekniska detaljer som kräver särskild uppmärksamhet vid installationen av ATOM-systemet. För det första är det viktigt att notera att asymmetrisk / skrå spektralkodad belysning kan införa restfasgradientkomponenter ( dvs skuggningseffekten) i absorptionskontrasten och påverka ökningen av fas-gradientkontrast i ATOM. Därför bör denna effekt av sned belysning minimeras. För det andra bör det betonas att tidsmultiplexerings- eller tidsinterleaving-ordningen med två replikor inte res…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar herr P. Yeung för att förbereda MCF-7 för oss. Detta arbete stöddes delvis av bidrag från forskningsrådet för Hongkongs särskilda förvaltningsregion, Kina (Projekt nr 17259316, 17207715, 17207714, 17205215 och HKU 720112E), innovations- och tekniskt stödprogram (ITS / 090/14 ) Och HKU: s utvecklingsfond.
Materials
| Nikon Plan Fluorite Physiology Objectives 40X | Nikon | MRF07420 | Objective lens (Obj2) |
| Olympus Plan Fluorite Objective, 0.75 NA, 0.51 mm WD, 40X | Olympus | RMS40X-PF | Objective lens (Obj1) |
| N-BK7 Plano-Convex Lenses | Thorlabs | LA1145-C | For relaying spectral shower |
| FC/APC Fiber Collimation Package | Thorlabs | F220APC-1064 | For outputing and collecting laser pulses |
| Pellicle beamsplitter | Thorlabs | BP145B3 | For making beam replica |
| Protected silver mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | For reflecting light |
| 800-1650nm 12GHz single mode DC-coupled NIR Photoreceiver | Newport | 1544-B | For converting light into electrical signal |
| Infiniium High-Performance Oscilloscope | Agilent | DSOX91604A | To save the light-converted electrical signals |
| HI1060 optical fiber | Corning | HI1060 | Optical fiber for time-stretch |
| YTTERBIUM DOPED FIBER AMPLIFIER | Keopsys | KPS-STD-BT-YFA-37-BO-SM-111-FA-FA | Optical in-line amplifier |
| Holographic grating | Wasatch Photonics | 020305-6 | Grating |
| Infuse/Withdraw Syringe Pumps | Harvard Apparatus | PHD 2000 | Syringe pump for sample loading in micro-fluidic channels |
References
- Lau, A. K. S., Wong, T. T. W., Shum, H. C., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K., Barteneva, N. S., Vorobjev, I. A. . Imaging Flow Cytometry: Methods and Protocols. , 23-45 (2016).
- Goda, K., Tsia, K. K., Jalali, B. Serial time-encoded amplified imaging for real-time observation of fast dynamic phenomena. Nature. 458 (7242), 1145-1149 (2009).
- Goda, K., Jalali, B. Dispersive Fourier transformation for fast continuous single-shot measurements. Nat Photon. 7 (2), 102-112 (2013).
- Lau, A. K., Shum, H. C., Wong, K. K., Tsia, K. K. Optofluidic time-stretch imaging – an emerging tool for high-throughput imaging flow cytometry. Lab Chip. 16 (10), 1743-1756 (2016).
- Lau, A. K. S., Tang, A. H. L., Xu, J., Wong, X. W., Y, K. K., Tsia, K. K. Optical Time Stretch for High-Speed and High-Throughput Imaging – From Single-Cell to Tissue-Wide Scales. IEEE J. Sel. Top. in Quant. Electron. 22 (4), (2016).
- Lei, C., Guo, B., Cheng, Z., Goda, K. Optical time-stretch imaging: Principles and applications. Appl Phys Rev. 3 (1), 011102 (2016).
- Lei, C., Guo, B., Cheng, Z., Goda, K. Optical time-stretch imaging: Principles and applications. Applied Physics Reviews. 3 (011102), (2016).
- Goda, K., et al. High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (29), 11630-11635 (2012).
- Goda, K., Solli, D. R., Tsia, K. K., Jalali, B. Theory of amplified dispersive Fourier transformation. Physical Review A. 80 (4), 043821 (2009).
- Goda, K., et al. High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (29), 11630-11635 (2012).
- Lai, Q. T. K., et al. High-throughput time-stretch imaging flow cytometry for multi-class classification of phytoplankton. Opt. Express. 24 (25), 28170-28184 (2016).
- Chen, C. L., et al. Deep Learning in Label-free Cell Classification. Sci Rep. 6, 21471 (2016).
- Fard, A. M., et al. Nomarski serial time-encoded amplified microscopy for high-speed contrast-enhanced imaging of transparent media. Biomed Opt Express. 2 (12), 3387-3392 (2011).
- Lau, A. K., et al. Interferometric time-stretch microscopy for ultrafast quantitative cellular and tissue imaging at 1 mum. J Biomed Opt. 19 (7), 76001 (2014).
- Mahjoubfar, A., Chen, C., Niazi, K. R., Rabizadeh, S., Jalali, B. Label-free high-throughput cell screening in flow. Biomed Opt Express. 4 (9), 1618-1625 (2013).
- Wong, T. T., et al. Asymmetric-detection time-stretch optical microscopy (ATOM) for ultrafast high-contrast cellular imaging in flow. Sci Rep. 4, 3656 (2014).
- Mata, T. M., Martins, A. A., Caetano, N. S. Microalgae for biodiesel production and other applications: A review. Renew Sustainable Energy Rev. 14 (1), 217-232 (2010).
- Irigoien, X., Huisman, J., Harris, R. P. Global biodiversity patterns of marine phytoplankton and zooplankton. Nature. 429 (6994), 863-867 (2004).
- Wei, X., et al. Coherent Laser Source for High Frame-Rate Optical Time-Stretch Microscopy at 1.0 µm. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 20 (5), 384-389 (2014).
- Wei, X., et al. Breathing laser as an inertia-free swept source for high-quality ultrafast optical bioimaging. Opt. Lett. 39 (23), 6593-6596 (2014).
- Xu, Y., Wei, X., Ren, Z., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. Ultrafast measurements of optical spectral coherence by single-shot time-stretch interferometry. Sci Rep. 6, 27937 (2016).
- Tsia, K. K., Goda, K., Capewell, D., Jalali, B. Performance of serial time-encoded amplified microscope. Opt. Express. 18 (10), 10016-10028 (2010).
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Challenges in circulating tumour cell research. Nat Rev Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).
- Kling, J. Beyond counting tumor cells. Nat Biotech. 30 (7), 578-580 (2012).
- Hodgkinson, C. L., et al. Tumorigenicity and genetic profiling of circulating tumor cells in small-cell lung cancer. Nat Med. 20 (8), 897-903 (2014).
- Ozkumur, E., et al. Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells. Sci Transl Med. 5 (179), (2013).
- Hou, H. W., et al. Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces. Scientific Reports. 3, 1259 (2013).
- Karabacak, N. M., et al. marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples. Nat. Protocols. 9 (3), 694-710 (2014).
- Krebs, M. G., et al. Molecular analysis of circulating tumour cells-biology and biomarkers. Nat Rev Clin Oncol. 11 (3), 129-144 (2014).
- Wu, J., et al. Ultrafast Laser-Scanning Time-Stretch Imaging at Visible Wavelengths. Light Sci Appl. , (2016).
