Индукция клеточной дифференцировки и визуализации отдельных клеток<em> Vibrio parahaemolyticus</em> Плоттеры и богомольцы
Summary
Этот протокол позволяет одноклеточную микроскопию дифференциально различающихся пловцов Vibrio parahaemolyticus и роевых клеток. Этот метод дает популяцию клеток рояля, легко доступную для анализа одной клетки, и охватывает подготовку клеточных культур, индукцию дифференциации роянов, подготовку образцов и анализ изображений.
Abstract
Способность изучать внутриклеточную локализацию белков имеет важное значение для понимания многих клеточных процессов. В свою очередь, это требует способности получать отдельные клетки для флуоресцентной микроскопии, что может быть особенно сложным при визуализации клеток, которые существуют в сообществах бактерий. Например, человеческий патоген Vibrio parahaemolyticus существует в виде коротких стержнеобразных пловчих клеток в жидких условиях, которые при поверхностном контакте дифференцируются в субпопуляцию сильно вытянутых клеток рояля, специализированных для роста на твердых поверхностях. В данной статье представлен метод проведения одноячеистого флуоресцентного микроскопического анализа V. parahaemolyticus в двух его дифференциальных состояниях. Этот протокол очень воспроизводимо индуцирует дифференциацию V. parahaemolyticus в жизненный цикл свиной клетки и облегчает их пролиферацию на твердых поверхностях. Этот метод дает вспышки дифференцированных клеток рояля, простирающихся от tОн – край стаи-колонии. Примечательно, что на самом кончике роевых вспышек ячейки рояля существуют в одном слое клеток, что позволяет легко переносить их на предметный стек микроскопа и последующую флюоресцентную микроскопию изображений отдельных клеток. Кроме того, представлен рабочий процесс анализа изображений для демографического представления бактериальных обществ. В качестве доказательства принципа описан анализ внутриклеточной локализации хемотаксисных сигнальных массивов в клетках пловца и свиньи V. parahaemolyticus.
Introduction
Бактерии постоянно испытывают изменения в своей внешней среде и разработали несколько методов изменения и адаптации своего поведения. Один из таких механизмов включает дифференциацию в различные типы клеток, которые лучше дополняют измененную среду. Дифференциация часто включает в себя значительные изменения в регуляции клеточного цикла, морфологии клеток и пространственно-временную организацию клеток. Один организм, который может дифференцироваться, – Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus принадлежит к Vibrionaceae , который является семейством протеобактерий, которые обычно обитают в пресной или соленой воде. Vibrionaceae широко распространены в окружающей среде и включают в себя несколько видов, которые вызывают инфекции кишечного тракта у людей, в том числе Vibrio cholerae.В. Parahaemolyticus – диморфный организм и способен дифференцироваться в два разных типа клеток в ответ на изменение егоВнешняя среда. В водных средах он существует как короткая стержнеобразная плоская клетка с одиночным полярным жгутиком, расположенным на старом полюсе клетки. При поверхностном контакте запускается дифференциация в рояльную клетку. Дифференциация клеток Swarmer включает в себя два основных изменения: морфогенез стайчатых клеток через торможение клеточного деления и индукцию второй системы жгутиков. Это приводит к формированию перифричной и сильно вытянутой палочковидной рояльной клетки, которая может либо продолжить образ жизни рояля, где события деления приводят к появлению клеток рогатого потомства, либо, альтернативно, дифференцируются обратно в клетки пловца.
Сообщалось о нескольких факторах, вызывающих или влияющих на дифференцировку рояля. Первичный стимул, по-видимому, управляется механосенсингом, где V. parahaemolyticus использует полярный жгутик в качестве тактильного датчика, который обнаруживает ингибирование вращения при поверхностном контакте, но некоторые другие факторы задействованы в качествеСкважина 1 . В лаборатории вращение полярного жгутика может быть искусственно ингибировано добавлением фенамила, который блокирует вегетарианное вращение натриевого канала, тем самым вызывая дифференцировку рояля 2 . Кроме того, в более раннем исследовании Vibrio alginolyticus был индуцирован для роения на твердых средах, когда клетки размножались на ростовой среде в чашке Петри, запечатанной прозрачной пластиковой лентой. Насыщенная щелочью фильтровальная бумага препятствовала роению в этих условиях, поэтому предполагалось, что одна или несколько летучих кислот могут участвовать в индукции роения. Таким образом, герметизация чашки Петри пластиковой лентой, вероятно, позволила накапливать летучие кислоты, образующиеся в качестве побочных продуктов клеточного метаболизма, в пределах свободного пространства пластины. Тот же эффект был достигнут, когда H 2 O 2 был добавлен к ростовой среде в незапечатанных чашках Петри для искусственного получения летучих кислот путем гидролиза компонентов среды <supClass = "xref"> 3 , 4 , 5 . Тем не менее, идентичность таких летучих кислот остается неизвестной. Более того, было показано, что избыточная доступность кальция 6 и железа-ограничения 7 как усиливает размножение рояля, так и пролиферацию на твердых поверхностях. Клетки могут голодать из-за железа, добавляя соединение 2,2'-бипиридил в среду для роста, которая, как было показано, влияет на дифференцировку рояля 8 . Факторы, известные регулировать дифференцировку, теперь реализуются при разработке протокола, который воспроизводимо индуцирует дифференциацию V. parahaemolyticus в клетки рояля и их пролиферацию на твердых поверхностях агара.
V. parahaemolyticus дифференцировка включает в себя значительные изменения в регуляции клеточного деления, клеточной морфологии и позиционирования макромолекулярных машин, таких как flagellА и хемотаксис – процессы, для которых все требуют специфической локализации белков в соответствии с клеточным циклом. Таким образом, способность изучать внутриклеточную локализацию таких белков является существенной для понимания вышеупомянутых клеточных процессов. Для проведения таких исследований требуется флуоресцентная микроскопия на отдельных клетках. Это может быть особенно сложным при визуализации клеток, которые существуют в плотных бактериальных популяциях, как это имеет место для роевых клеток. Были попытки побудить дифференцировку рояля в жидких средах, которые могли бы потенциально генерировать отдельные клетки для микроскопических исследований. И хотя на уровне транскрипции эти клетки частично индуцировали программу размножения рояликов, они не подвергаются таким же отчетливым морфологическим изменениям, как полностью дифференцированные клетки свиньи, выращенные на твердой среде 8 . Эта статья предлагает надежный и воспроизводимый протокол метода, чтобы вызвать ройер се11 на поверхности агара. Протокол дает популяцию легкодоступных клеток свиньи, легко доступных для одноэлементной микроскопии и последующего анализа. Кроме того, протокол позволяет провести локализацию флуоресцентно меченых белков как в клетках пловец, так и в рояльных клетках (разделы 1, 2, 3, 4). Кроме того, протокол описывает последующий рабочий процесс о том, как обрабатывать и анализировать сгенерированные данные из экспериментов по флуоресцентной микроскопии, что позволяет проводить демографический анализ бактериальных сообществ (раздел 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье описывается метод микроскопии изображений рояльных клеток V. parahaemolyticus с последующим анализом, направленным на разрешение и количественную оценку субклеточной локализации и других особенностей изученных флуоресцентно меченных белков. Хотя существуют нескольк…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана обществом Макса Планка.
Materials
| Media components | |||
| LB-medium | Roth | X968.3 | |
| Difco Agar, granulated | BD | 214510 | For preparation of LB agar with LB-medium |
| Difco Heart Infusion Agar | BD | 244400 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Agarose NEEO, ultra quality | Roth | 2267.3 | For preparation of microscopy agarose pads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additives | |||
| L-arabinose | Roth | 5118.3 | Used to induce pBAD derivatives |
| 2,2`-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305-25G | For preparation of HI agar swarming plates |
| Calcium chloride dihydrate | Roth | 5239.1 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Ampicillin sodium salt | Roth | K029.3 | |
| Chloramphenicol | Roth | 3886.3 | |
| PBS buffer | – | – | Standard recipe for Phosphate-buffered saline |
| D(+) Sucrose | Roth | 4621.1 | For preparation of electrocompetent cells |
| Glycerol | Roth | 3783.5 | For preparation of electrocompetent cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hardware | |||
| Petri dish 150x20mm with cams | Sarstedt | 82.1184.500 | For preparation of HI agar swarming plates |
| kelvitron t (B 6420) | Heraeus | – | Used for drying HI agar swarming plates |
| Gene Pulser Xcell Microbial System | BioRad | 1652662 | Used for elctroporation of plasmid DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| MetaMorph Offline (version 7.7.5.0) | Molecular Devices | – | Used for microscopy image analysis |
| Excel | Microsoft | – | Used for microscopy data analsis |
References
- McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar dynamometer controls swarmer cell differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
- Kawagishi, I., Imagawa, M., Imae, Y., McCarter, L., Homma, M. The sodium-driven polar flagellar motor of marine Vibrio as the mechanosensor that regulates lateral flagellar expression. Mol. Microbiol. 20 (4), 693-699 (1996).
- Ulitzur, S. Induction of swarming in Vibrio parahaemolyticus. Arch. Microbiol. 101 (4), 357-363 (1974).
- Ulitzur, S. Effect of temperature, salts, pH, and other factors on the development of peritrichous flagella in Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (3), 285-288 (1975).
- Ulitzur, S. The mechanism of swarming of Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (1), 67-71 (1975).
- Gode-Potratz, C. J., Chodur, D. M., McCarter, L. L. Calcium and iron regulate swarming and type III secretion in Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 192 (22), 6025-6038 (2010).
- McCarter, L., Silverman, M. Iron regulation of swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 171 (2), 731-736 (1989).
- Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol. Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
- Heering, J., Ringgaard, S. Differential Localization of Chemotactic Signaling Arrays during the Lifecycle of Vibrio parahaemolyticus. Front Microbiol. 7 (November), 1-12 (2016).
- Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division. mBio. 5 (3), (2014).
- Development Core Team, R. F. F. S. C. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. 1, 2673 (2008).
- Ringgaard, S., et al. ParP prevents dissociation of CheA from chemotactic signaling arrays and tethers them to a polar anchor. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (2), E255-E264 (2014).
- Ringgaard, S., Schirner, K., Davis, B. M., Waldor, M. K. A family of ParA-like ATPases promotes cell pole maturation by facilitating polar localization of chemotaxis proteins. Genes Dev. 25, 1544-1555 (2011).
- Vischer, N. O. E., et al. Cell age dependent concentration of Escherichia coli divisome proteins analyzed with ImageJ and ObjectJ. Front Microbiol. 6 (JUN), (2015).
- Schneider, C. a., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics. Mol. Microbiol. 80 (3), 612-627 (2011).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nat. Microbiol. 1, 16077 (2016).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays. J. Vis. Exp. (98), e52338 (2015).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Mol. Microbiol. 99 (4), 767-777 (2016).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. -. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J. Vis. Exp. (53), e1-e6 (2011).
