מודל הלב הפוכה עבור אוסף transstate Interstitial מן הלב עכברוש מבודד
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה לאסוף נוזל interstitial לב מבודדים, בלב עכברוש perfused. כדי להפריד פיזית transudate interstitial מ perfossate כלילי ורידי לב, הלב Langendorff perfused הוא הפוך, ואת transudate (נוזל interstitial) נוצר על פני הלב נאסף באמצעות כובע לטקס רכה.
Abstract
הפרוטוקול הנוכחי מתאר גישה ייחודית המאפשרת אוסף של transudate לב (CT) מן הלב מבודד, מלוחים perfused חולדה. לאחר בידוד ו זלילה מדרדר של הלב על פי טכניקת Langendorff, הלב הוא הפוך למצב הפוך הפוכה מיוצב מכנית על ידי קטטר בלון מוכנס לתוך החדר השמאלי. ואז, כובע לטקס דק – בעבר יצוק כדי להתאים את הגודל הממוצע של הלב חולדה – ממוקם מעל פני השטח epichardial. השקע של כובע לטקס מחובר צינורות סיליקון, עם פתיחת דיסטלי 10 ס"מ מתחת לרמת הבסיס של הלב, יצירת יניקה קלה. CT מיוצר ברציפות על פני השטח אפיקארדיאל נאסף בקבוקונים מקורר כקרח לניתוח נוסף. שיעור היווצרות ה- CT נע בין 17 ל -147 μL / min (n = 14) בשליטה ובליבות לא מקובעות, המייצגות 0.1-1% מהפרפוראטציה הקולית הוורידית. ניתוח פרוטאומי ופרפו גבוהRmance נוזל כרומטוגרפיה (HPLC) גילה כי CT שנאספו מכיל מגוון רחב של חלבונים ו metinerolic purinergic.
Introduction
אי ספיקת לב (HF) היא הגורם המוביל למוות בבני אדם בעולם 1 . HF מתרחשת לעיתים קרובות עקב דלקת שריר הלב, עלבונות איסכמיים בשריר הלב, ושיפוץ חדרי החדר, מה שמוביל להידרדרות הדרגתית של תפקוד הלב וכלי הדם של המטופלים. למרות ההתקדמות הקרדיולוגית וניתוח לב הורידו באופן משמעותי את תמותה HF, הם רק לשמש "מעכבים" חולף של תהליך מחלה מתקדמת באופן בלתי נמנע, כי יש תחלואה משמעותית. לכן, היעדר הטיפול היעיל הנוכחי מדגיש את הצורך לזהות מטרות מולקולריות חדשות שיכולות למנוע או אפילו להפוך HF. הדבר כולל שינויים במטריצה החוץ-תאית, תגובה חיסונית בלתי מבוקרת של הלב, ואינטראקציות בין תאי לב ולא-לב 2 .
חשוב להכיר כי microenvironment כי תאים לב חשופים direcTly צורות התגובה החיסונית והתחדשות של הלב הפגוע. בלב המבודד, המלוח-מלוח, נוצר CT על פני השטח בצורת טיפות קטנות הנגזרות מחלל הנוזלים הבין-ממדי ( כלומר, מיקרו-סביבה), הן בתנאים פיזיולוגיים והן בפאתופיזיולוגיים 3 , 4 , 5 . לכן, ניתוח של CT ( כלומר, נוזל interstitial) עשוי לעזור לזהות גורמים המווסתים את חילוף החומרים של הלב ואת תפקוד התכווצות 6 או להשפיע על תפקודי התא החיסונית לאחר המעבר אל הלב הפגוע. פוטנציאל זה עשוי להוביל לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לטיפול ב- HF.
אוסף CT מ לבבות Murine הוא מאתגר מבחינה טכנית. ב Langendorff-perfused לבבות רגילים, את האוסף הבלעדי של CT קשה כי תערובת של CT עם קורונארY ורידי שפכים ורידי באופן בלתי צפוי מדלל כל ריכוז של מטבוליטים / אנזימים ששוחררו מן החלל interstitial. אחת האסטרטגיות האפשריות להתגבר על הגבלה זו היא להוציא את השפכים הוורידים על ידי חשיפת הריאתי ובאותו זמן ליגנציה של הווריד הריאתי. עם זאת, שיטה זו עומדת בפני קשיים הקשורים cannulation ו קשירת של העורק הריאתי ואת הווריד, גרימת דליפה פוטנציאלית של שפכים ורידי לתוך transudate הלב. הרעיון של שימוש במודל לב הפוכה הוצג לראשונה על ידי קבוצת קמרמאייר, שהפכה את הלב המבודד והמבודד למצב הפוך, והניחה כובע לטקס דק על משטח האפיכארדיאל כדי למדוד ללא הרף את ה- CT ללא זיהום של שפכים ורידיים 8 , 9 . באמצעות הליך זה, CT הוצגה לספק מדד רגיש מאוד של מטבוליטים שוחרר מהלב 9 ,העברה נימית של חומצות שומן 8 , וחלקיקים נגיפיים 10 .
לאחרונה, גורמי פרקרין שיכולים להסדיר את התגובה החיסונית המקומית ולהגדיל את אנגיוגנזה לב 11 היו מעורבים בהשפעות החיוביות של טיפול מבוסס תאי גזע למחלות לב. הניתוח של CT בלב הפוך עשוי לסייע לזהות את הגורמים הפרקריים האישיים הללו באופן כימי. בנוסף, CT עשוי לעזור לזהות את הגורמים המעורבים ההפעלה vivo של תאים חיסוניים בלב.
התיאור המפורט של אוסף ה- CT ממשטח הלב, הניתן כאן, הוא שימושי עבור חוקרים החוקרים את יחסי הגומלין בין תאי החיסון, fibroblasts, תאי האנדותל, ואת cardiomyocytes ביחס לתפקוד הלב הכולל. כפי שצוין לעיל, נוזל interstitial נושאת את המידע לתקשורת תא אל תוך התא, בתוך הלב, WHIch ניתן להעריך בנוחות על ידי אוסף של CT. תיאור טכני מפורט, כולל פרוטוקול וידאו של איך לאסוף CT מן הלב הפוכה, צריך להקל על היישום העתידי של טכניקה ייחודית זו.
Protocol
Representative Results
Discussion
מודל הלב הפוכה מבוסס על טכניקת זלוף הלב המבוצעת היטב של Langendorff 12 , והיא מבוצעת על ידי הפיכת הלב למצב הפוך ולהחזקה בתנוחה זו באמצעות קטטר נוקשה בתוך חדר הבלון. בדרך זו, transudate interstitial הלב יכול להיות מופרד פיזית מן perfusate כלילי ורידי, נוטף על ידי כוח הכבידה מן הב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי NSFC 81570244, Foko 23/2013, SFB 1116 / B01 ועל ידי מכון המחקר לב וכלי דם דיסלדורף (CARID).
Materials
| Latex Solution | ProChemie | Z-Latex LA-TZ | http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latexla-tz%E2%80%A8 |
| Aluminum Mold | Home made | – | Reverse heart model |
| Universal Ovens | Memmert | UNB 400 | Reverse heart model |
| Latex Balloon | Hugo Sachs | Size 4 | Reverse heart model |
| Milling Machine | Proxxon | MF70 | Reverse heart model |
| Sodium Chloride | Sigma | SZBD0810V | Chemicals |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Roth | 68852 | Chemicals |
| Potassium Chloride | Merck | 49361 | Chemicals |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Merck | 58861 | Chemicals |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Merck | 48731 | Chemicals |
| D(+)-Glucose Anhydrous | Merck | 83371 | Chemicals |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fluka | 21097 | Chemicals |
| Balance | VWR | SE 1202 | Weighing chemicals |
| Double Distilled Water | Millpore | – | Disolving chemicals |
| Medical Pressure Transducer | Gold | – | Langendorff apparatus |
| Medical Flow Probe | Transonic | 3PXN | Langendorff apparatus |
| Heating Circulating Bath | Haake | B3 ; DC1 | Langendorff apparatus |
| Laboratory and Vaccum Tubing | Tygon | R-3603 | Langendorff apparatus |
| Animal Research Flowmeters | Transonic | T206 | Langendorff apparatus |
| PowerLab Data Acquisition Device | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| LabChart Data Acquisition Software | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| Peristaltic Pump | Glison | MINIPULS 3 | Langendorff apparatus |
| Glass Water Column | home made | – | Langendorff apparatus |
| Water Bath Protective Agent | VWR | 462-7000 | Langendorff apparatus |
| Sterile Disposable Filters (0.2µm) | Thermo Scientific | 595-4520 | Langendorff apparatus |
| Blood gas analyzers | Radiometer | ABL90 FLEX PLUS | Gas analyzer |
| 70% ethanol | VWR | UN1170 | Cleaning tubings |
| 100% ethanol | Merck | 64-17-5 | Cleaning tubings |
| Wistar Rats | Janvier | – | Animals |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC702R | Surgical Instruments |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC257R | Surgical Instruments |
| Big Forceps | AESCULAP | – | Surgical Instruments |
| 8m/m Stainless Forceps | F.S.T | 11052-10 | Surgical Instruments |
| superfine (10/0) emery paper | 3M | 051111-11694 | Reverse heart model |
References
- Henkel, D. M., Redfield, M. M., Weston, S. A., Gerber, Y., Roger, V. L. Death in heart failure: a community perspective. Circ Heart Fail. 1 (2), 91-97 (2008).
- Limana, F., et al. Myocardial infarction induces embryonic reprogramming of epicardial c-kit(+) cells: role of the pericardial fluid. J Mol Cell Cardiol. 48 (4), 609-618 (2010).
- Brunner, F. Cardiac tissue endothelin-1 levels under basal, stimulated, and ischemic conditions. J Cardiovasc Pharmacol. 26, S44-S46 (1995).
- de Lannoy, L. M., et al. Renin-angiotensin system components in the interstitial fluid of the isolated perfused rat heart. Local production of angiotensin I. Hypertension. 29 (6), 1240-1251 (1997).
- Strupp, M., Kammermeier, H. Interstitial Lactate And Glucose-Concentrations Of the Isolated-Perfused Rat-Heart before, during And after Anoxia. Pflugers Arch. 423 (3-4), 232-237 (1993).
- Wienen, W., Jungling, E., Kammermeier, H. Enzyme-Release into the Interstitial Space of the Isolated Rat-Heart Induced by Changes in Contractile Performance. Cardiovasc Res. 28 (8), 1292-1298 (1994).
- De Deckere, E. A., Ten Hoor, ., P, A modified Langendorff technique for metabolic investigations. Pflugers Arch. 370 (1), 103-105 (1977).
- Tschubar, F., Rose, H., Kammermeier, H. Fatty acid transfer across the myocardial capillary wall. J Mol Cell Cardiol. 25 (4), 355-366 (1993).
- Wienen, W., Kammermeier, H. Intra- and extracellular markers in interstitial transudate of perfused rat hearts. Am J Physiol. 254 (4 Pt 2), H785-H794 (1988).
- Sasse, A., Ding, Z. P., Wallich, M., Godecke, A., Schrader, J. Vascular transfer of adenovirus is augmented by nitric oxide in the rat heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (3), H1362-H1368 (2004).
- Gnecchi, M., Zhang, Z., Ni, A., Dzau, V. J. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy. Circ Res. 103 (11), 1204-1219 (2008).
- Herr, D. J., Aune, S. E., Menick, D. R. Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts. J Vis Exp. (101), e52908 (2015).
- Ding, Z., et al. Epicardium-Derived Cells Formed After Myocardial Injury Display Phagocytic Activity Permitting In Vivo Labeling and Tracking. Stem Cells Transl Med. 5 (5), 639-650 (2016).
- Hartwig, S., et al. Secretome profiling of primary human skeletal muscle cells. Biochim Biophys Acta. 1844 (5), 1011-1017 (2014).
- Smolenski, R. T., Lachno, D. R., Ledingham, S. J. M., Yacoub, M. H. Determination of sixteen nucleotides, nucleosides and bases using high-performance liquid chromatography and its application to the study of purine metabolism in hearts for transplantation. J Chromatogr. 527 (2), 414-420 (1990).
- Decking, U. K., Juengling, E., Kammermeier, H. Interstitial transudate concentration of adenosine and inosine in rat and guinea pig hearts. Am J Physiol. 254 (6 Pt 2), H1125-H1132 (1988).
- Heller, L. J., Mohrman, D. E. Estimates of interstitial adenosine from surface exudates of isolated rat hearts. J Mol Cell Cardiol. 20 (6), 509-523 (1988).
