Il modello invertito del cuore per la raccolta di transudati interstiziali dal cuore isolato del ratto
Summary
Questo protocollo descrive un metodo per raccogliere il liquido interstiziale cardiaco dal cuore isolato del ratto perfuso. Per separare fisicamente il transudato interstiziale dal perfusato effluente venoso coronarico, il cuore perfuso di Langendorff viene invertito e il liquido intradito (transversato) formato sulla superficie cardiaca viene raccolto usando un tappo morbido in lattice.
Abstract
Il presente protocollo descrive un approccio unico che consente la raccolta del transudato cardiaco (CT) dal cuore isolato del ratto perfuso-salino. Dopo l'isolamento e la perfusione retrograda del cuore secondo la tecnica Langendorff, il cuore viene invertito in posizione verticale e stabilizzato meccanicamente da un catetere a palloncino inserito nel ventricolo sinistro. Quindi, un cappuccio di lattice sottile – precedentemente gettato per abbinare la dimensione media del cuore del topo – è posto sopra la superficie epicardica. L'uscita del tappo in lattice è collegata al tubo di silicone, con l'apertura distale 10 cm sotto il livello base del cuore, creando una leggera aspirazione. Il CT prodotto continuamente sulla superficie epicardica è raccolto in flaconi raffreddati al ghiaccio per ulteriori analisi. Il tasso di formazione di CT variava da 17 a 147 μL / min (n = 14) nei cuori di controllo e infarto, che rappresenta lo 0,1-1% del perfusato venoso effusivo coronarico. Analisi proteomica e alto perfoLa cromatografia liquida rmance (HPLC) ha rivelato che la CT raccolta contiene un ampio spettro di proteine e metaboliti purinergici.
Introduction
L'insufficienza cardiaca (HF) è la principale causa di morte negli esseri umani in tutto il mondo 1 . L'HF si verifica spesso a causa della miocardite, insulti ischemici al miocardio e rimodellamento ventricolare sinistro, che porta al progressivo deterioramento della funzione contrattile cardiaca e alla qualità della vita dei pazienti. Sebbene i progressi nella cardiologia e nella chirurgia cardiaca abbiano notevolmente ridotto la mortalità della HF, essi servono semplicemente come "ritardatori" transitori di un processo di malattia inevitabilmente progressivo che ha una grave morbosità. Pertanto, l'attuale mancanza di trattamento efficace sottolinea la necessità di identificare nuovi bersagli molecolari che possono impedire o addirittura invertire l'HF. Ciò include cambiamenti nella matrice extracellulare, risposta immunitaria incontrollata cardiaca e interazioni tra cellule cardiache e non cardiache 2 .
È importante riconoscere che il microambiente che le cellule cardiache sono esposte a direcForma la risposta immunitaria e rigenerativa del cuore infortunato. Nel cuore isolato, salato-perfuso, CT viene generato sulla superficie del cuore sotto forma di piccole gocce derivate dallo spazio fluido interstiziale ( cioè, microambiente), sia in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche 3 , 4 , 5 . Pertanto, l'analisi del CT ( cioè il fluido interstiziale) può aiutare a identificare fattori che regolano il metabolismo cardiaco e la funzione contrattile 6 o influenzano le funzioni delle cellule immunitarie dopo la migrazione nel cuore ferito. Potenzialmente, ciò può portare allo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per il trattamento dell'HF.
La raccolta di CT da cuori murine è tecnicamente impegnativa. Nei corpi regolari di Langendorff, la collezione esclusiva di CT è difficile perché la miscela di CT con coronarL'effluente venoso effusivo diluisce imprevedibilmente qualsiasi concentrazione di metaboliti / enzimi liberati dallo spazio interstiziale. Una possibile strategia per superare questa limitazione è quella di escludere l'effluente venoso cannulando il polmone e contemporaneamente legando la vena polmonare 7 . Tuttavia, questo metodo affronta difficoltà associate alla cannulazione e alla legatura dell'arteria e della vena polmonare, causando perdite potenziali di effluenti venosi nel transudato cardiaco. Il concetto di utilizzo di un modello di cuore inverso è stato introdotto per la prima volta dal gruppo di Kammermeier, che ha invertito il cuore isolato e perfuso in una posizione capovolta e ha posto un cappuccio di lattice sottile sulla superficie epicardica per continuare a campionare CT senza la contaminazione dell'effetto venoso 8 , 9 . Utilizzando questa procedura, CT è stato dimostrato di fornire una misura molto sensibile dei metaboliti liberati dal cuore 9 ,Il trasferimento capillare di acidi grassi 8 e le particelle virali 10 .
Più recentemente, i fattori paracrini che possono regolare la risposta immunitaria locale e aumentare l'angiogenesi cardiaca 11 sono stati implicati negli effetti benefici della terapia basata sulle cellule staminali per le malattie cardiache. L'analisi della CT nel cuore inverso può aiutare a identificare chimicamente questi fattori paracrini individuali. Inoltre, la CT può aiutare a identificare i fattori coinvolti nell'attivazione in vivo di cellule immunitarie nel cuore.
La descrizione dettagliata della raccolta CT dalla superficie del cuore, fornita qui, è sperimentalmente utile per i ricercatori che studiano l'interazione di cellule immunitarie, fibroblasti, cellule endoteliali e cardiomiociti in relazione alla funzione cardiaca globale. Come detto sopra, il fluido interstiziale trasporta le informazioni per la comunicazione cellulare da cellule nel cuore, whChe può essere convenientemente valutato dalla raccolta di CT. La descrizione tecnica dettagliata, incluso un protocollo video su come raccogliere CT dal cuore invertito, dovrebbe facilitare l'applicazione futura di questa tecnica unica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il modello di cuore invertito si basa sulla ben nota tecnica di perfusione del cuore Langendorff 12 e viene eseguita semplicemente invertendo il cuore in una posizione capovolta e tenendo questa posizione utilizzando un rigido catetere a palloncino intra-ventricolare. In tal modo, il transudato interstiziale cardiaco può essere fisicamente separato dal perfusato effluente venoso coronarico, gocciolando per gravità dalla base del cuore 9 . La CT può essere raccolta in co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato finanziato da NSFC 81570244, FoKo 23/2013 e SFB 1116 / B01 e dall'Istituto di Ricerca Cardiovascolare Düsseldorf (CARID).
Materials
| Latex Solution | ProChemie | Z-Latex LA-TZ | http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latexla-tz%E2%80%A8 |
| Aluminum Mold | Home made | – | Reverse heart model |
| Universal Ovens | Memmert | UNB 400 | Reverse heart model |
| Latex Balloon | Hugo Sachs | Size 4 | Reverse heart model |
| Milling Machine | Proxxon | MF70 | Reverse heart model |
| Sodium Chloride | Sigma | SZBD0810V | Chemicals |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Roth | 68852 | Chemicals |
| Potassium Chloride | Merck | 49361 | Chemicals |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Merck | 58861 | Chemicals |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Merck | 48731 | Chemicals |
| D(+)-Glucose Anhydrous | Merck | 83371 | Chemicals |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fluka | 21097 | Chemicals |
| Balance | VWR | SE 1202 | Weighing chemicals |
| Double Distilled Water | Millpore | – | Disolving chemicals |
| Medical Pressure Transducer | Gold | – | Langendorff apparatus |
| Medical Flow Probe | Transonic | 3PXN | Langendorff apparatus |
| Heating Circulating Bath | Haake | B3 ; DC1 | Langendorff apparatus |
| Laboratory and Vaccum Tubing | Tygon | R-3603 | Langendorff apparatus |
| Animal Research Flowmeters | Transonic | T206 | Langendorff apparatus |
| PowerLab Data Acquisition Device | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| LabChart Data Acquisition Software | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| Peristaltic Pump | Glison | MINIPULS 3 | Langendorff apparatus |
| Glass Water Column | home made | – | Langendorff apparatus |
| Water Bath Protective Agent | VWR | 462-7000 | Langendorff apparatus |
| Sterile Disposable Filters (0.2µm) | Thermo Scientific | 595-4520 | Langendorff apparatus |
| Blood gas analyzers | Radiometer | ABL90 FLEX PLUS | Gas analyzer |
| 70% ethanol | VWR | UN1170 | Cleaning tubings |
| 100% ethanol | Merck | 64-17-5 | Cleaning tubings |
| Wistar Rats | Janvier | – | Animals |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC702R | Surgical Instruments |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC257R | Surgical Instruments |
| Big Forceps | AESCULAP | – | Surgical Instruments |
| 8m/m Stainless Forceps | F.S.T | 11052-10 | Surgical Instruments |
| superfine (10/0) emery paper | 3M | 051111-11694 | Reverse heart model |
References
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