単離されたラット心臓からのインタースティシャル透過性収集のための逆心モデル
Summary
このプロトコルは、単離され、灌流されたラット心臓から心臓間質液を収集する方法を記載している。冠状静脈流出液灌流液から間質液透過液を物理的に分離するために、Langendorff灌流心臓を反転させ、心臓表面上に形成された経液透過液（間質液）を軟質ラテックスキャップを用いて収集する。
Abstract
本プロトコルは、単離された生理食塩水灌流ラット心臓からの心臓通過液（CT）の収集を可能にする独自のアプローチを記載している。 Langendorff技術による心臓の単離および逆行灌流の後、心臓は逆さまの位置に反転され、左心室に挿入されたバルーンカテーテルによって機械的に安定化される。次に、薄いラテックスキャップ（ラットの心臓の平均サイズと一致するように予めキャスト）を心外膜表面に配置する。ラテックスキャップの出口は、シリコンチューブに接続されており、遠位開口部は心臓の基底レベルより10cm下にあり、わずかな吸引力を生じさせる。心外膜表面上で連続的に産生されたCTを、さらなる分析のために氷冷バイアル中に集める。 CT形成速度は、対照および梗塞心臓では17〜147μL/分（n = 14）であり、これは冠動脈静脈流出液灌流液の0.1〜1％に相当する。プロテオーム分析および高PERFO液体クロマトグラフィー（HPLC）は、収集されたCTが広範囲のタンパク質およびプリン代謝産物を含むことを明らかにした。
Introduction
心不全（HF）は、世界中のヒトの主要死因である1 。 HFは、心筋炎、心筋への虚血性傷害、および左心室リモデリングのためにしばしば起こり、心臓の収縮機能および患者の生活の質が漸進的に悪化する。心臓病および心臓手術の進歩はHFの死亡率を著しく低下させるが、重大な病的状態を伴う必然的に進行する疾患プロセスの一時的な遅延因子として機能するだけである。したがって、有効な治療の現在の欠如は、HFを予防または逆転することができる新規な分子標的を同定する必要性を強調している。これには、細胞外マトリックスの変化、制御されない心臓免疫応答、および心臓と非心臓の細胞との相互作用が含まれる2 。
心臓の細胞がdirecにさらされる微環境負傷した心臓の免疫応答および再生応答を形成する。単離された生理食塩水灌流心臓において、CTは、生理学的および病態生理学的条件下で、間質液空間（ すなわち微小環境）に由来する小さな液滴の形態で心臓表面上に生成される3,4,5 。したがって、CT（ すなわち、間質液）の分析は、心臓の代謝および収縮機能を調節する因子を同定するか、または損傷した心臓に移動した後に免疫細胞の機能に影響を与える因子を同定するのに役立ち得る。潜在的に、これは、HFの治療のための新規治療戦略の開発につながる可能性がある。
マウスの心臓からのCTの収集は技術的に困難です。通常のランゲンドルフ灌流心臓では、CTの独占的収集は困難である。なぜなら、CTとコロナ静脈流出物の灌流液は、間質腔から放出された代謝産物/酵素の濃度を予測して希釈する。この制限を克服するための1つの可能な戦略は、肺にカニューレを挿入し、同時に肺静脈を結紮することによって静脈流出液を排除することである。しかしながら、この方法は、肺動脈および静脈のカニューレ挿入および結紮に伴う困難に直面し、静脈流出液の心臓滲出液への潜在的な漏出を引き起こす。逆心モデルを使用するという概念は、隔離された灌流された心臓を逆さまにし、心外膜表面に薄いラテックスキャップを置き、静脈流出物の汚染なしに連続的にCTをサンプリングするKammermeierのグループによって初めて導入された8,9 。この手順を使用して、CTは、心臓9から放出された代謝産物の非常に敏感な尺度を提供することが示されたが、脂肪酸8 、およびウイルス粒子10の毛細管移動を含む。
より最近では、局所免疫応答を調節し、心血管新生を増大させるパラクリン因子が、心臓病の幹細胞に基づく治療の有益な効果に関与している。逆心臓におけるCTの分析は、これらの個々のパラクリン因子を化学的に同定するのに役立ち得る。さらに、CTは、心臓における免疫細胞のインビボ活性化に関与する因子を同定するのに役立ち得る。
本明細書で提供される、心臓表面からのCT収集の詳細な説明は、免疫細胞、線維芽細胞、内皮細胞および心筋細胞の全体的な心機能との相互作用を研究する研究者にとって実験的に有用である。上述したように、間質液は、心臓内の細胞間通信のための情報を運び、whCTの収集によって簡便に評価することができる。逆心臓からCTを収集する方法のビデオプロトコルを含む詳細な技術的説明は、この独特な技術の将来の適用を容易にするはずである。
Protocol
Representative Results
Discussion
逆心モデルは、十分に確立されたLangendorff心臓灌流技術12に基づいており、心臓を逆さまの位置に単純に反転させ、剛体の心室バルーンカテーテルを使用してこの位置を保持することによって実行される。このようにして、心臓間質液透過物は、心臓9の基部から重力によって滴下する冠状静脈流出物灌流液から物理的に分離することができる。 CTは、心臓?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NSFC 81570244、FoKo 23/2013、およびSFB 1116 / B01および心臓血管研究所デュッセルドルフ（CARID）によって資金提供された。
Materials
| Latex Solution | ProChemie | Z-Latex LA-TZ | http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latexla-tz%E2%80%A8 |
| Aluminum Mold | Home made | – | Reverse heart model |
| Universal Ovens | Memmert | UNB 400 | Reverse heart model |
| Latex Balloon | Hugo Sachs | Size 4 | Reverse heart model |
| Milling Machine | Proxxon | MF70 | Reverse heart model |
| Sodium Chloride | Sigma | SZBD0810V | Chemicals |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Roth | 68852 | Chemicals |
| Potassium Chloride | Merck | 49361 | Chemicals |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Merck | 58861 | Chemicals |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Merck | 48731 | Chemicals |
| D(+)-Glucose Anhydrous | Merck | 83371 | Chemicals |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fluka | 21097 | Chemicals |
| Balance | VWR | SE 1202 | Weighing chemicals |
| Double Distilled Water | Millpore | – | Disolving chemicals |
| Medical Pressure Transducer | Gold | – | Langendorff apparatus |
| Medical Flow Probe | Transonic | 3PXN | Langendorff apparatus |
| Heating Circulating Bath | Haake | B3 ; DC1 | Langendorff apparatus |
| Laboratory and Vaccum Tubing | Tygon | R-3603 | Langendorff apparatus |
| Animal Research Flowmeters | Transonic | T206 | Langendorff apparatus |
| PowerLab Data Acquisition Device | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| LabChart Data Acquisition Software | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| Peristaltic Pump | Glison | MINIPULS 3 | Langendorff apparatus |
| Glass Water Column | home made | – | Langendorff apparatus |
| Water Bath Protective Agent | VWR | 462-7000 | Langendorff apparatus |
| Sterile Disposable Filters (0.2µm) | Thermo Scientific | 595-4520 | Langendorff apparatus |
| Blood gas analyzers | Radiometer | ABL90 FLEX PLUS | Gas analyzer |
| 70% ethanol | VWR | UN1170 | Cleaning tubings |
| 100% ethanol | Merck | 64-17-5 | Cleaning tubings |
| Wistar Rats | Janvier | – | Animals |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC702R | Surgical Instruments |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC257R | Surgical Instruments |
| Big Forceps | AESCULAP | – | Surgical Instruments |
| 8m/m Stainless Forceps | F.S.T | 11052-10 | Surgical Instruments |
| superfine (10/0) emery paper | 3M | 051111-11694 | Reverse heart model |
References
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