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Abstract
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신경과학

Mesurer l’endocytose de la vésicule synaptique dans des neurones Hippocampal cultivés

Published: September 04, 2017
doi:
10.3791/55862
, ,
1National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 2College of Pharmacy,Chung-ang University

Summary

Endocytose Vésicule synaptique est détectée par microscopie de pHluorin fusionnée avec des protéines de la vésicule synaptique et par microscopie électronique de l’absorption de la vésicule.

Abstract

Au cours de l’endocytose, fusion des vésicules synaptiques sont récupérées dans les terminaisons nerveuses, permettant de recyclage de la vésicule et donc l’entretien de la transmission synaptique au moment du tir nerf répétitives. Avec facultés affaiblies endocytose dans certaines pathologies conduit à une diminution des fonctions synaptiques de force et le cerveau. Nous décrivons ici les méthodes utilisées pour mesurer l’endocytose de la vésicule synaptique synaptique hippocampal mammifères en culture neuronale. Nous avons suivi l’endocytose de protéine Vésicule synaptique en fusionnant une protéine de la membrane de vésicules synaptiques, y compris synaptophysine et VAMP2/synaptobrévine, sur le côté lumière vésiculaire, avec pHluorin, une protéine fluorescente verte sensibles au pH qui augmente sa intensité de la fluorescence lorsque le pH augmente. Au cours de l’exocytose, pH lumen vésiculaire augmente, alors qu’au cours de la lumière vésiculaire endocytose pH est re-acidifié. Ainsi, une augmentation de l’intensité de fluorescence pHluorin indique fusion, alors qu’une diminution indique l’endocytose de la protéine marquée des vésicules synaptiques. Outre l’utilisation de la méthode d’imagerie pHluorin pour enregistrer l’endocytose, nous avons suivi endocytose de la membrane vésiculaire par microscopie électronique (me) mesures d’absorption de raifort peroxydase de raifort (HRP) par des vésicules. Enfin, nous avons suivi la formation de fosses terminal membrane nerveuse à des moments différents après forte dépolarisation induite par le potassium. L’évolution temporelle de la HRP absorption et membrane fosse formation indique l’évolution temporelle de l’endocytose.

Introduction

Neurotransmetteurs sont stockées dans des vésicules synaptiques et libérées par exocytose. La membrane des vésicules synaptiques et la protéine sont internalisés par endocytose, puis réutilisés dans la prochaine série d’exocytose. L’endocytose des vésicules synaptiques est important pour le maintien des piscines de la vésicule synaptique et supprime la saillie vésicules de la membrane plasmique. La protéine fluorescente verte sensibles au pH pHluorin, qui est trempé dans des conditions acides et dequenched à pH neutre, a été utilisé pour mesurer le temps d’endocytose cours à vivent les cellules1,2,3. La protéine pHluorin est généralement attachée au côté lumière des protéines des vésicules synaptiques, comme synaptophysine ou VAMP2/synaptobrévine. Au repos, pHluorin est trempé dans le lumen de pH 5,5 des vésicules synaptiques. La fusion des vésicules de la membrane plasmique expose la lumière vésiculaire à la solution extracellulaire où le pH est ~ 7,3, résultant en une augmentation pHluorin de fluorescence. Après exocytose, l’augmentation de la fluorescence décroît, en raison de l’endocytose des protéines Vésicule synaptique, suivie par une vésicule ré-acidification dans ces vésicules récupérés. Bien que la désintégration reflète l’endocytose et vésiculaire ré-acidification, il reflète surtout endocytose, parce que la réacidification est plus rapide que l’endocytose dans la plupart des conditions1,4. La constante de temps de ré-acidification est 3-4 s ou moins5,6, qui est généralement plus rapide que les 10 s ou plus requis pour la vésicule endocytose4,5. Si les expériences sont nécessaires pour distinguer l’endocytose de ré-acidification, les expériences trempe acides avec un pH de 5.5 à l’aide de la solution de (MES) acide 4-Morpholineethanesulfonic (25 mM) peuvent être utilisés pour déterminer si les protéines des vésicules synaptiques sont récupérés de la membrane plasmique par endocytose1,3,4. Ainsi, l’augmentation d’intensité de fluorescence pHluorin fait apparaître un solde d’exo – et l’endocytose et la diminution après une stimulation nerveuse reflète précisément l’endocytose.

pHluorin imagerie peut être utilisé non seulement pour mesurer l’évolution temporelle de l’endocytose, mais aussi la taille des vésicules synaptiques piscines7,8, et la probabilité de libération évoquée et spontanée de sortie9. Plusieurs facteurs et les protéines impliquées dans la régulation de l’endocytose, tels que le calcium, les protéines solubles NSF-attachment protein receptor (SNARE), factor(BDNF) neurotrophique dérivé du cerveau et de la calcineurine sont identifiés au moyen d’imagerie pHluorin1 , 2 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16. en outre, la libération du neurotransmetteur pouvait être détectée dans les neurones pas primaires mais dans les cellules de neuroblastome avec TIRFM17. Récemment, pHTomato, dsRed, mOrange et variantes de pHluorin ont été développés pour le suivi des enregistrements simultanés de facteurs multiples dans une seule synapse18,19. Par exemple, pHTomato a été fusionné avec synaptophysine et utilisé avec un indicateur de calcium génétiquement encodé (GCaMP5K) pour surveiller la fusion des vésicules présynaptiques et l’influx de Ca2 + dans le compartiment post-synaptique20. Par conséquent, pHluorin attaché aux protéines synaptiques fournit une méthode utile pour analyser la relation entre l’endocytose et l’exocytose.

EM est une autre méthode couramment utilisée pour étudier l’endocytose, en raison de la haute résolution spatiale qui montre les changements ultrastructuraux au cours de l’endocytose. Deux domaines généraux sont la possibilité de visualiser des changements pathologiques dans les cellules neuronales21 et de suivre les vésicules protéines22. En particulier, l’observation d’absorption de la vésicule synaptique, courbure de membrane enduite de clathrine dans la zone de periactive, et les structures endosomale sont possibles avec EM3,23,24,25 ,26,27,28. Tandis qu’EM implique des artefacts potentiels, tels que des malformations induites par le fixateur, qui peuvent affecter l’endocytose, et analyse des données est de main-d’oeuvre, que la résolution offre la possibilité de visualiser la structure cellulaire attrayante. Les problèmes potentiels de fixateur et la limitation en résolution temporelle EM peuvent être surmontés en haute pression, congélation, fournissant une méthode rapide et non chimiques de stabiliser les structures délicates présents au cours de l’endocytose27.

Protocol

Remarque : le protocole suivant décrit les méthodes d’imagerie pHluorin et les méthodes de EM utilisés dans des neurones hippocampal cultivés. pHluorin moniteurs Vésicule synaptique protéine absorption dans les cellules vivantes et EM détecte l’absorption des vésicules synaptiques et modifications ultrastructurales. soins aux animaux et la procédure suivie NIH guidelines et ont été approuvés par le Comité de l’utilisation et le NIH animalerie. …

Representative Results

En utilisant la méthode de transporteur de lipides, SpH a été exprimé dans les neurones de l’hippocampe, permettant l’identification des boutons (Figure 1 a). La stimulation électrique des cellules induites par exocytose et une augmentation correspondante dans l’intensité de la fluorescence. L’augmentation de fluorescence (ΔF) a été arrêtée en mettant fin à la stimulation (Figure 1 b). L’augmentation de la f…

Discussion

Nous démontrons ici deux méthodes pour surveiller l’endocytose de la vésicule synaptique. Dans la première méthode, nous avons suivi pHluorin fondu avec une protéine de la vésicule synaptique dans les neurones transfectées et stimulé par la suite électriquement. Deuxièmement, nous avons utilisé l’imagerie EM d’absorption HRP car induite par le KCl. Nous avons utilisé différents stimuli pour deux raisons. Tout d’abord, application de potassium élevé induit une dépolarisation de tous les neurones d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions m. Zhu Yong-Ling prévoyant la fourniture VAMP2-phluorin de construction synaptophysine-pHluorin2x et Dr. James E. Rothman. Nous remercions le Dr Susan Cheng et Virginia Crocker de NINDS Electron Microscopy Facility pour leur soutien technique et aide. Ce travail a été soutenu par le National Institute of Neurological Disorders et programme de recherche intra-muros accident vasculaire cérébral aux États-Unis et une subvention de la KRIBB Research Initiative (programme coréen biomédicale scientifique Fellowship), Korea Research Institute of Bioscience et biotechnologie, République de Corée.

Materials

Lipofectamine LTX with Plus Thermo Fisher 15338-100 Transfection of plasmid DNA including synaptophysin or VAMP2-pHluorin
neurobasal medium Thermo Fisher 21103-049 Growth medium for neuron, Warm up to 37°C before use
B27 Thermo Fisher 17504-044 Gradient for neuronal differentiation
Glutamax Thermo Fisher 35050-061 Gradient for neuronal culture
Poly-D-Lysine coated coverslip Neuvitro GG-25-pdl Substrate for neuronal growth and imaging of pHluorin
Trypsin XI from bovine pancrease Sigma T1005 Neuronal culture-digest hippocampal tissues
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma D5025 Neuronal culture-inhibits viscous cell suspension
pulse stimulator A-M systems model 2100 Apply electrical stimulation
Slotted bath with field stimulation Warner Instruments RC-21BRFS Apply electrical stimulation
stimulus isolation unit Warner Instruments SIU102 Apply electrical stimulation
lubricant Dow corning 111 pHluorin imaging-seal with coverslip and imaging chamber, avoid leak from chamber
AP5 Tocris 3693 Gradient for normal saline, selective NMDA receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity
CNQX Tocris 190 Gradient for normal saline, competitive AMPA/kainate receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity
Illuminator Nikon C-HGFI Metal halide light source for pHluorin
EMCCD camera Andor iXon3 pHluorin imaging, detect pHluorin fluorescence intensity
Inverted microscopy Nikon Ti-E Imaging for synaptophysin or VAMP2 pHluorin transfected cells
NIS-Elements AR Nikon NIS-Elements Advanced Research Software for imaging acquisition and analysis
Igor Pro WaveMetrics Igor pro Software for imaging analysis and data presentation
imaging chamber Warner Instruments RC21B pHluorin imaging, apply field stimulation on living cells
poly-l-lysine Sigma P4832 Electron microscopy, substrate for neuronal growth, apply on multiwell plate for 1 h at room temperature then wash with sterilized water 3 times
Horseradish peroxidase(HRP) Sigma P6782 Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by catalyzing DAB in presence hydrogen peroxide, final concentration is 5 mg/mL in normal saline, make fresh before use
Na cacodylate Electron Microscopy Sciences 12300 Electron microscopy, buffer for fixatives and washing, final concentration is 0.1 N
3,3′-Diaminobenzidine(DAB) Sigma D8001 Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles, substrate for HRP, final concentration is 0.5 mg/mL in DDW and filtered, make fresh before use
Hydrogen peroxide solution Sigma H1009 Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by inducing HRP-DAB reaction, final concentration is 0.3% in DDW, make fresh before use
glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences 16365 Electron microscopy, fixatives, final concentration is 4% in Na-cacodylate buffer, make fresh before use, shake well before to use
TEM JEOL 200CX Electron microscopy, imaging of endocytosed vesicles and ultrastructural changes
CCD digital camera AMT XR-100 Electron microscopy, capturing images
Lead citrate Leica microsystems 16707235 Electron microscopy, grid staining
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Synaptic Vesicle EndocytosisHippocampal NeuronsPoly-d-lysineHigh Potassium StimulationGlutaraldehydeSodium Cacodylate BufferDAB SolutionOsmium TetroxideSodium Acetate BufferUranyl AcetateDehydrationElectron Microscopy
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Villarreal, S., Lee, S. H., Wu, L. Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (127), e55862, doi:10.3791/55862 (2017).
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