培養海馬神経細胞のシナプス小胞エンドサイトーシスを測定
Summary
光顕微鏡によるシナプス小胞タンパク質と融合した 1p-169 と吸収小胞の電子顕微鏡によるシナプス小胞エンドサイトーシスが検出されました。
Abstract
エンドサイトーシス、時にシナプス小胞の融合は小胞リサイクルそしてこうして神経反復焼成時におけるシナプス伝達の維持を可能にする神経終末で取得されます。病理学の条件に障害エンドサイトーシスは、シナプスの強さと脳の機能の低下につながります。ここでは、我々 は哺乳類神経培養海馬シナプスにおけるシナプス小胞エンドサイトーシスを測定するために使用方法を説明します。我々 は pHluorin、増加 pH 敏感な緑色蛍光タンパク質を小胞の内腔側でシナプトフィジンと VAMP2/シナプトブレビンを含むシナプス小胞膜タンパク質を融合することでシナプス小胞タンパク質エンドサイトーシスを監視、pH として蛍光強度が増加します。エキソサイトーシス、時小胞内腔 pH が増加し、pH は酸性再エンドサイトーシス小胞内腔中。したがって、pHluorin の蛍光強度の増加は減少を示す標識のシナプス小胞タンパク質のエンドサイトーシスに対し融合を示します。PHluorin イメージング法を使用して、エンドサイトーシスを記録するに加え、膜小胞エンドサイトーシスの監視西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP) 摂取量の電子顕微鏡検査 (EM) 測定による小胞によって。最後に、我々 は神経末端の穴を形成する高カリウム誘起脱分極後様々 な時を監視しました。HRP 吸収と膜ピット形成の時間的経過は、エンドサイトーシスの時間コースを示します。
Introduction
神経伝達物質は、シナプス小胞に格納され、エキソサイトーシスによってリリースされました。シナプス小胞膜および蛋白質は、エンドサイトーシス、によって、開口放出の次のラウンドで再利用します。シナプス小胞エンドサイトーシスは、細胞膜から突き出た小胞を削除しますシナプス小胞のプールを維持するため重要です。酸性情況で急冷、中性 pH で蛍光 pH 敏感な緑色蛍光タンパク質 pHluorin は、エンドサイトーシス時間コース ライブ セル1,2,3を測定する使用されています。PHluorin 蛋白質は通常シナプトフィジンや VAMP2/シナプトブレビンなどのシナプス小胞タンパク質の内腔側に接続されています。でも、pHluorin はシナプス小胞の 5.5 の pH ルーメンで急冷され。細胞膜に小胞の融合を公開、pH が 7.3 〜 細胞外の溶液に小胞の内腔 pHluorin 蛍光性の増加の結果します。エキソサイトーシス後、シナプス小胞蛋白質それら回復小胞内小胞再酸性化に続いてのエンドサイトーシスによる増加の蛍光が崩壊します。崩壊は、エンドサイトーシスと小胞の再酸性化を反映しているが、再酸性化がほとんど条件1,4エンドサイトーシスよりも速いのでそれ主のエンドサイトーシスを反映します。再酸性の時定数は 3-4 秒または 10 よりも一般に高速は5,6に少ない s 以上の小胞エンドサイトーシス4,5に必要な。シナプス小胞タンパク質を取得するかどうかを決定する 5.5 の pH の 4 Morpholineethanesulfonic 酸 (MES) 溶液 (25 mM) を用いた酸焼入れ実験を使用ことができます実験が再酸性からエンドサイトーシスを区別するために必要な場合エンドサイトーシス1,3,4を介して原形質膜。したがって、pHluorin 蛍光強度増加エキソおよびエンドサイトーシス、残高反映して反映されます神経刺激後減少特にエンドサイトーシス。
確率誘発リリースと自発的な解放9および pHluorin イメージングがエンドサイトーシスの時間のコースもシナプス小胞プール7、8サイズを測定するだけではなく使えます。多くの要因とエンドサイトーシスなどカルシウム、水溶性 NSF 添付ファイル蛋白質受容体 (スネア) 蛋白質、脳由来神経栄養 factor(BDNF)、カルシニューリンの調節に関与するタンパク質は、pHluorin イメージング1を使用して識別されています。,2,10,11,12,13,14,15,16. 唯一の第一次ニューロンではなく観察17神経芽細胞腫、さらに、神経伝達物質の放出が検出できます。最近では、pHluorin 亜種、下流、mOrange、pHTomato は、単一シナプス18,19で複数の要因を同時記録を監視するため開発されました。たとえば、pHTomato シナプトフィジンと融合され遺伝的コード化カルシウム インジケーター (GCaMP5K) とシナプス小胞の融合およびシナプス コンパートメント20の Ca2 +流入監視に使用します。そのため、シナプス蛋白質に接続されている pHluorin は、エンドサイトーシスとエキソサイトーシスとの関係を分析する有用な方法を提供します。
EM は一般的エンドサイトーシス中の微細構造の変化を示す高空間分解能のためのエンドサイトーシスを研究するために使用する別の方法です。2 つの一般的な領域は、神経細胞21内の病理学的変化を視覚化し、小胞蛋白質22を追跡する機能です。特に、シナプス小胞の取り込み、膜の曲率の観察 periactive ゾーンにクラスリン被覆し、エンドソーム構造が EM3,23,24,25 で可能 ,26,,2728。EM で定着剤による奇形などの潜在的なアーティファクトは、エンドサイトーシス、影響を与える可能性があります、データ分析は労働集約型、解像度は細胞構造を視覚化するための魅力的な機会を提供します。潜在的な定着性の問題と EM の時間分解能の限界は、凍結、エンドサイトーシス27の間に現在の繊細な構造の安定化の高速で非化学メソッドを提供する高圧で克服できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、シナプス小胞エンドサイトーシスを監視するための 2 つの方法を示します。最初のメソッドでは、pHluorin transfected ニューロンのシナプス小胞タンパク質と融合し、その後電気刺激を監視しました。第二に、kcl と HRP 取り込みの EM イメージングを使用しました。2 つの理由のためにさまざまな刺激を使いました。まず、高カリウム施肥は文化のすべてのニューロンの脱分極を誘導し?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
朱永陵先生にありがとう VAMP2 phluorin を提供するため、シナプトフィジン pHluorin2x 構造と博士ジェームズ e. ロスマンを提供します。彼らのテクニカル サポートおよびヘルプ、博士スーザン ・ チェンと組織プラスミノーゲンアクテベータ電子顕微鏡施設のバージニア クロッカーに感謝します。この作品は国立研究所の神経疾患と脳卒中学内研究プログラム米国の生命研究イニシアティブ プログラム (韓国生物医学科学者フェローシップ プログラム)、韓国研究所からの助成金によって支持されました。バイオ サイエンスとバイオ テクノロジー、大韓民国。
Materials
| Lipofectamine LTX with Plus | Thermo Fisher | 15338-100 | Transfection of plasmid DNA including synaptophysin or VAMP2-pHluorin |
| neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | Growth medium for neuron, Warm up to 37°C before use |
| B27 | Thermo Fisher | 17504-044 | Gradient for neuronal differentiation |
| Glutamax | Thermo Fisher | 35050-061 | Gradient for neuronal culture |
| Poly-D-Lysine coated coverslip | Neuvitro | GG-25-pdl | Substrate for neuronal growth and imaging of pHluorin |
| Trypsin XI from bovine pancrease | Sigma | T1005 | Neuronal culture-digest hippocampal tissues |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 | Neuronal culture-inhibits viscous cell suspension |
| pulse stimulator | A-M systems | model 2100 | Apply electrical stimulation |
| Slotted bath with field stimulation | Warner Instruments | RC-21BRFS | Apply electrical stimulation |
| stimulus isolation unit | Warner Instruments | SIU102 | Apply electrical stimulation |
| lubricant | Dow corning | 111 | pHluorin imaging-seal with coverslip and imaging chamber, avoid leak from chamber |
| AP5 | Tocris | 3693 | Gradient for normal saline, selective NMDA receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity |
| CNQX | Tocris | 190 | Gradient for normal saline, competitive AMPA/kainate receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity |
| Illuminator | Nikon | C-HGFI | Metal halide light source for pHluorin |
| EMCCD camera | Andor | iXon3 | pHluorin imaging, detect pHluorin fluorescence intensity |
| Inverted microscopy | Nikon | Ti-E | Imaging for synaptophysin or VAMP2 pHluorin transfected cells |
| NIS-Elements AR | Nikon | NIS-Elements Advanced Research | Software for imaging acquisition and analysis |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for imaging analysis and data presentation |
| imaging chamber | Warner Instruments | RC21B | pHluorin imaging, apply field stimulation on living cells |
| poly-l-lysine | Sigma | P4832 | Electron microscopy, substrate for neuronal growth, apply on multiwell plate for 1 h at room temperature then wash with sterilized water 3 times |
| Horseradish peroxidase(HRP) | Sigma | P6782 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by catalyzing DAB in presence hydrogen peroxide, final concentration is 5 mg/mL in normal saline, make fresh before use |
| Na cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | Electron microscopy, buffer for fixatives and washing, final concentration is 0.1 N |
| 3,3′-Diaminobenzidine(DAB) | Sigma | D8001 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles, substrate for HRP, final concentration is 0.5 mg/mL in DDW and filtered, make fresh before use |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | H1009 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by inducing HRP-DAB reaction, final concentration is 0.3% in DDW, make fresh before use |
| glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16365 | Electron microscopy, fixatives, final concentration is 4% in Na-cacodylate buffer, make fresh before use, shake well before to use |
| TEM | JEOL | 200CX | Electron microscopy, imaging of endocytosed vesicles and ultrastructural changes |
| CCD digital camera | AMT | XR-100 | Electron microscopy, capturing images |
| Lead citrate | Leica microsystems | 16707235 | Electron microscopy, grid staining |
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