Måle Synaptic Vesicle endocytose i kulturperler hippocampus nerveceller
Summary
Synaptiske vesicle endocytose oppdages ved * lys av pHluorin smeltet sammen med synaptic vesicle protein og elektronmikroskop for vesicle opptak.
Abstract
Under endocytose hentes smeltet synaptic blemmer på nerve terminaler, slik at vesicle resirkulering og dermed vedlikehold av synaptic overføring under repeterende nerve avfyring. Nedsatt endocytose patologiske forhold fører til nedgang i synaptiske styrke og hjernen fungerer. Her beskriver vi metoder brukes til å måle synaptic vesicle endocytose på pattedyr hippocampus synapse i neuronal kultur. Vi overvåket synaptic vesicle protein endocytose kombinerer en synaptic vesicula membran protein, inkludert synaptophysin og VAMP2/synaptobrevin, på vesicula lumenal side, med pHluorin, en pH-sensitive grønne fluorescerende protein som øker sin fluorescens intensiteten som pH øker. Under exocytosis, vesicula lumen pH øker, mens under endocytose vesicula lumen pH er nytt sur. Dermed indikerer en økning av pHluorin fluorescens fusion, mens en nedgang angir endocytose av merket synaptic vesicle protein. I tillegg til metoden pHluorin imaging for å registrere endocytose, overvåket vi vesicula membran endocytose av elektronmikroskop (EM) målinger av pepperrot peroxidase (HRP) opptak av blemmer. Til slutt, vi overvåket dannelsen av nerve terminalen membran groper i ulike tider etter høy kalium-indusert depolarization. Time course of HRP opptak og membran grav formasjon angir time course of endocytose.
Introduction
Nevrotransmittere er lagret i synaptic blemmer og utgitt av exocytosis. Den synaptiske vesicle membran protein er internalisert endocytose, og på nytt i neste runde av exocytosis. Endocytose av synaptic blemmer er viktig for å opprettholde synaptic vesicle bassenger og fjerner utstående blemmer fra plasma membranen. PH-sensitive grønne fluorescerende protein pHluorin, som er slukket under Sure forhold og dequenched i nøytral pH, har blitt brukt til å måle endocytose tiden kurs i lever celler1,2,3. PHluorin protein er vanligvis knyttet til lumenal siden av synaptic vesicle proteiner, for eksempel synaptophysin eller VAMP2/synaptobrevin. Ved hvile, er pHluorin slukket i 5,5 pH lumen av synaptic blemmer. Vesicle fusion å plasma membranen eksponerer den vesicula lumen til ekstracellulære løsning der pH er ~ 7.3, resulterer i en økning i pHluorin fluorescens. Etter exocytosis, økt fluorescens henfaller, på grunn av endocytose synaptic vesicle proteiner etterfulgt av vesicle re forsuring innenfor de gjenopprettede blemmer. Selv om forfallet gjenspeiler både endocytose og vesicula re forsuring, gjenspeiler hovedsakelig endocytose, fordi re forsuring er raskere enn endocytose i de fleste forhold1,4. Tiden konstant av re forsuring er 3-4 s eller mindre5,6, som er generelt raskere enn 10 s eller mer kreves for vesicle endocytose4,5. Hvis eksperimenter er nødvendig å skille endocytose fra re forsuring, kan acid slukke eksperimenter med 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) løsningen (25 mM) med en pH på 5.5 brukes til å bestemme om synaptic vesicle proteiner er Hentet fra plasma membranen via endocytose1,3,4. Dermed pHluorin fluorescens intensitet økningen gjenspeiler en balanse av exo- og endocytose, og nedgangen etter nervestimulering spesifikt gjenspeiler endocytose.
pHluorin imaging kan brukes ikke bare til å måle tid selvfølgelig endocytose, men også størrelsen på synaptic vesicle bassenger7,8, og sannsynligheten for vakte utgivelsen og spontan slipp9. Mange faktorer og proteiner involvert i å regulere endocytose, som kalsium, løselig NSF-vedlegg protein reseptor (SNARE) proteiner, hjerne-avledet nevrotropisk factor(BDNF) og calcineurin har blitt identifisert ved hjelp av pHluorin bildebehandling1 , 2 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16. videre utgivelsen av nevrotransmitter kan oppdages i ikke bare primære neurons men i neuroblastom celler med TIRFM17. Nylig ble pHluorin varianter, dsRed, mOrange og pHTomato utviklet for å overvåke samtidig opptak av flere faktorer i en enkelt synapse18,19. For eksempel er pHTomato smeltet sammen med synaptophysin og brukes med en genetisk kodet kalsium indikator (GCaMP5K) til å overvåke presynaptic vesicle fusion og Ca2 + tilstrømningen i postsynaptic rommet20. Derfor gir pHluorin knyttet til synaptic proteiner en nyttig metode for å analysere forholdet mellom endocytose og exocytosis.
EM er en annen metode brukes vanligvis til å studere endocytose, på grunn av høy romlig oppløsning som viser ultrastructural endringer under endocytose. To generelle områder er muligheten til å visualisere patologiske forandringer i neuronal celler21 og spore vesicle proteiner22. Spesielt observasjon av synaptic vesicle opptak, membran kurvatur belagt med clathrin i den periactive sonen, og endosomal strukturer er mulig med EM3,23,24,25 ,26,27,28. Mens EM involverer potensielle artefakter som bindemiddel-indusert misdannelser, som kan påvirke endocytose og dataanalyse er arbeidsintensiv, oppløsningen gir en attraktiv mulighet å visualisere cellestruktur. Potensielle etappe, den stabiliserende problemer og begrensning i EM midlertidig løsning kan overvinnes ved høyt trykk frysing, gir en rask og ikke-kjemisk metode til å stabilisere skjøre strukturer under endocytose27.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her viser vi to metoder for å kartlegge synaptic vesicle endocytose. I den første metoden overvåket vi pHluorin smeltet sammen med et synaptic vesicle protein i transfekterte nevroner og senere påtrykkes. Dernest brukte vi EM avbilding av HRP opptak som forårsaket av KCl. Vi brukte ulike stimuli for to grunner. Først høyt kalium programmet induserer depolarization for alle neurons i kulturen. Dette forenkler EM undersøkelse, gitt at vår EM-metode ikke kan skille mellom ikke-stimulert og stimulert neurons. Andre,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Yong-Ling Zhu for å gi synaptophysin-pHluorin2x konstruksjon og Dr. James E. Rothman for å gi VAMP2-phluorin. Vi takker Dr. Susan Cheng og Virginia Crocker NINDS elektronmikroskop anlegg for kundestøtte og hjelp. Dette arbeidet ble støttet av National Institute av nevrologiske lidelser og hjerneslag Intramural Research Program i USA og et stipend fra KRIBB initiativ forskningsprogrammet (koreansk biomedisinsk forsker Fellowship Program), Korea forskningsinstitutt Bioscience og bioteknologi, Sør-Korea.
Materials
| Lipofectamine LTX with Plus | Thermo Fisher | 15338-100 | Transfection of plasmid DNA including synaptophysin or VAMP2-pHluorin |
| neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | Growth medium for neuron, Warm up to 37°C before use |
| B27 | Thermo Fisher | 17504-044 | Gradient for neuronal differentiation |
| Glutamax | Thermo Fisher | 35050-061 | Gradient for neuronal culture |
| Poly-D-Lysine coated coverslip | Neuvitro | GG-25-pdl | Substrate for neuronal growth and imaging of pHluorin |
| Trypsin XI from bovine pancrease | Sigma | T1005 | Neuronal culture-digest hippocampal tissues |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 | Neuronal culture-inhibits viscous cell suspension |
| pulse stimulator | A-M systems | model 2100 | Apply electrical stimulation |
| Slotted bath with field stimulation | Warner Instruments | RC-21BRFS | Apply electrical stimulation |
| stimulus isolation unit | Warner Instruments | SIU102 | Apply electrical stimulation |
| lubricant | Dow corning | 111 | pHluorin imaging-seal with coverslip and imaging chamber, avoid leak from chamber |
| AP5 | Tocris | 3693 | Gradient for normal saline, selective NMDA receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity |
| CNQX | Tocris | 190 | Gradient for normal saline, competitive AMPA/kainate receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity |
| Illuminator | Nikon | C-HGFI | Metal halide light source for pHluorin |
| EMCCD camera | Andor | iXon3 | pHluorin imaging, detect pHluorin fluorescence intensity |
| Inverted microscopy | Nikon | Ti-E | Imaging for synaptophysin or VAMP2 pHluorin transfected cells |
| NIS-Elements AR | Nikon | NIS-Elements Advanced Research | Software for imaging acquisition and analysis |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for imaging analysis and data presentation |
| imaging chamber | Warner Instruments | RC21B | pHluorin imaging, apply field stimulation on living cells |
| poly-l-lysine | Sigma | P4832 | Electron microscopy, substrate for neuronal growth, apply on multiwell plate for 1 h at room temperature then wash with sterilized water 3 times |
| Horseradish peroxidase(HRP) | Sigma | P6782 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by catalyzing DAB in presence hydrogen peroxide, final concentration is 5 mg/mL in normal saline, make fresh before use |
| Na cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | Electron microscopy, buffer for fixatives and washing, final concentration is 0.1 N |
| 3,3′-Diaminobenzidine(DAB) | Sigma | D8001 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles, substrate for HRP, final concentration is 0.5 mg/mL in DDW and filtered, make fresh before use |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | H1009 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by inducing HRP-DAB reaction, final concentration is 0.3% in DDW, make fresh before use |
| glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16365 | Electron microscopy, fixatives, final concentration is 4% in Na-cacodylate buffer, make fresh before use, shake well before to use |
| TEM | JEOL | 200CX | Electron microscopy, imaging of endocytosed vesicles and ultrastructural changes |
| CCD digital camera | AMT | XR-100 | Electron microscopy, capturing images |
| Lead citrate | Leica microsystems | 16707235 | Electron microscopy, grid staining |
References
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nature cell biol. 2 (4), 197-204 (2000).
- Sun, T., Wu, X. S., et al. The role of calcium/calmodulin-activated calcineurin in rapid and slow endocytosis at central synapses. J Neurosci. 30 (35), 11838-11847 (2010).
- Wu, X. -. S. S., Lee, S. H., et al. Actin Is Crucial for All Kinetically Distinguishable Forms of Endocytosis at Synapses. Neuron. 92 (5), 1020-1035 (2016).
- Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51 (6), 773-786 (2006).
- Atluri, P. P., Ryan, T. A. The kinetics of synaptic vesicle reacidification at hippocampal nerve terminals. J Neurosci. 26 (8), 2313-2320 (2006).
- Royle, S. J., Granseth, B., Odermatt, B., Derevier, A., Lagnado, L. Imaging phluorin-based probes at hippocampal synapses. Methods Mol Biol. 457, 293-303 (2008).
- Moulder, K. L., Mennerick, S. Reluctant vesicles contribute to the total readily releasable pool in glutamatergic hippocampal neurons. J Neurosci. 25 (15), 3842-3850 (2005).
- Li, Z., Burrone, J., Tyler, W. J., Hartman, K. N., Albeanu, D. F., Murthy, V. N. Synaptic vesicle recycling studied in transgenic mice expressing synaptopHluorin. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (17), 6131-6136 (2005).
- Morris, R. G. Elements of a neurobiological theory of hippocampal function: the role of synaptic plasticity, synaptic tagging and schemas. Eur J Neurosci. 23 (11), 2829-2846 (2006).
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Calcium accelerates endocytosis of vSNAREs at hippocampal synapses. Nat Neurosci. 4 (2), 129-136 (2001).
- Balaji, J., Armbruster, M., Ryan, T. A. Calcium control of endocytic capacity at a CNS synapse. J Neurosci. 28 (26), 6742-6749 (2008).
- Ferguson, S. M., Brasnjo, G., et al. A selective activity-dependent requirement for dynamin 1 in synaptic vesicle endocytosis. Science. 316 (5824), 570-574 (2007).
- Baydyuk, M., Wu, X. S., He, L., Wu, L. G. Brain-derived neurotrophic factor inhibits calcium channel activation, exocytosis, and endocytosis at a central nerve terminal. J Neurosci. 35 (11), 4676-4682 (2015).
- Wu, X. S., Zhang, Z., Zhao, W. D., Wang, D., Luo, F., Wu, L. G. Calcineurin is universally involved in vesicle endocytosis at neuronal and nonneuronal secretory cells. Cell Rep. 7 (4), 982-988 (2014).
- Zhang, Z., Wang, D., et al. The SNARE proteins SNAP25 and synaptobrevin are involved in endocytosis at hippocampal synapses. J Neurosci. 33 (21), 9169-9175 (2013).
- Wu, L. -. G. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annu Rev Physiol. 76 (1), 301-331 (2014).
- Daniele, F., Di Cairano, E. S., Moretti, S., Piccoli, G., Perego, C. TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in SH-SY5Y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis. J Vis Exp. (95), e52267 (2015).
- Shaner, N. C., Lin, M. Z., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (6), 545-551 (2008).
- Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat Neurosci. 15 (7), 1047-1053 (2012).
- Leitz, J., Kavalali, E. T. Fast retrieval and autonomous regulation of single spontaneously recycling synaptic vesicles. Elife. 3, e03658 (2014).
- Bisht, K., El Hajj, H., Savage, J. C., Sánchez, M. G., Tremblay, M. -. &. #. 2. 0. 0. ;. Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with β-Amyloid Plaques. J Vis Exp. (112), e54060 (2016).
- Schikorski, T. Monitoring Synaptic Vesicle Protein Sorting with Enhanced Horseradish Peroxidase in the Electron Microscope. High-Resolution Imaging of Cellular Proteins: Methods and Protocols. , 327-341 (2016).
- Kononenko, N. L., Puchkov, D., et al. Clathrin/AP-2 mediate synaptic vesicle reformation from endosome-like vacuoles but are not essential for membrane retrieval at central synapses. Neuron. 82 (5), 981-988 (2014).
- Wu, Y., O’Toole, E. T., et al. A dynamin 1-, dynamin 3- and clathrin-independent pathway of synaptic vesicle recycling mediated by bulk endocytosis. eLife. 2014 (3), e01621 (2014).
- Heuser, J. E., Reese, T. S. Evidence for recycling of synaptic vesicle membrane during transmitter release at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol. 57 (2), 315-344 (1973).
- Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Turnover of transmitter and synaptic vesicles at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol. 57 (2), 499-524 (1973).
- Watanabe, S., Rost, B. R., et al. Ultrafast endocytosis at mouse hippocampal synapses. Nature. 504 (7479), 242-247 (2013).
- Watanabe, S., Trimbuch, T., et al. Clathrin regenerates synaptic vesicles from endosomes. Nature. 515 (7526), 228-233 (2014).
- Sankaranarayanan, S., Atluri, P. P., Ryan, T. A. Actin has a molecular scaffolding, not propulsive, role in presynaptic function. Nat Neurosci. 6 (2), 127-135 (2003).
- Zhu, Y., Xu, J., Heinemann, S. F. Two pathways of synaptic vesicle retrieval revealed by single-vesicle imaging. Neuron. 61 (3), 397-411 (2009).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Arnao, M. B. B., Acosta, M., del Rio, J. A. A., García-Cánovas, F. Inactivation of peroxidase by hydrogen peroxide and its protection by a reductant agent. Biochim Biophys Acta. 1038 (1), 85-89 (1990).
- Deák, F., Schoch, S., et al. Synaptobrevin is essential for fast synaptic-vesicle endocytosis. Nat Cell Biol. 6 (11), 1102-1108 (2004).
- Clayton, E. L., Evans, G. J. O., Cousin, M. A. Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation. J Neurosci. 28 (26), 6627-6632 (2008).
- Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nat Neurosci. 17 (1), 10-16 (2014).
- Wienisch, M., Klingauf, J. Vesicular proteins exocytosed and subsequently retrieved by compensatory endocytosis are nonidentical. Nat Neurosci. 9 (8), 1019-1027 (2006).
- Fernández-Alfonso, T., Kwan, R., Ryan, T. A. Synaptic vesicles interchange their membrane proteins with a large surface reservoir during recycling. Neuron. 51 (2), 179-186 (2006).
- Gimber, N., Tadeus, G., Maritzen, T., Schmoranzer, J., Haucke, V. Diffusional spread and confinement of newly exocytosed synaptic vesicle proteins. Nat Commun. 6, 8392 (2015).
- Nicholson-Fish, J. C., Smillie, K. J., Cousin, M. A. Monitoring activity-dependent bulk endocytosis with the genetically-encoded reporter VAMP4-pHluorin. J Neurosci Methods. 266, 1-10 (2016).
- Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nat Protoc. 1 (6), 2970-2978 (2006).
- Wisse, E., Braet, F., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World journal of gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing Photodamage in Live-Cell Microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
- Søndergaard, C. R., Garrett, A. E., et al. Structural artifacts in protein-ligand X-ray structures: implications for the development of docking scoring functions. J Med Chem. 52 (18), 5673-5684 (2009).
