Mäta synaptiskt vesikelprotein endocytos i odlade nervceller i hippocampus
Summary
Synaptiskt vesikelprotein endocytos upptäcks genom ljusmikroskop av pHluorin smält med synaptiskt vesikelprotein protein och elektronmikroskopi av vesikler upptag.
Abstract
Under endocytos hämtas smält synaptiska vesikler på nerv terminaler, möjliggör vesikler återvinning och därmed underhållet av synaptisk transmission under repetitiva nerv bränning. Nedsatt endocytos i patologiska förhållanden leder till minskningar i synaptisk styrka och hjärnans funktioner. Här, beskriver vi metoder som används för att mäta synaptiskt vesikelprotein endocytos på däggdjur Hippocampus synapsen i neuronala kultur. Vi övervakas synaptiskt vesikelprotein protein endocytos av fusing en synaptisk vesikulär membranprotein, inklusive synaptophysin och VAMP2/synaptobrevin, på vesikulär lumenal sida, med pHluorin, en pH-känsliga grönt fluorescerande protein som ökar dess fluorescensintensiteten som pH ökar. Under exocytos, vesikulär lumen pH ökar, medan under endocytos vesikulär lumen pH är åter försurade. Således visar en ökning med pHluorin fluorescensintensiteten fusion, medan en minskning visar endocytos av proteinet märkta synaptiskt vesikelprotein. Förutom att använda metoden pHluorin imaging för att registrera endocytos, övervakas vi vesikulär membran endocytos av elektronmikroskopi (EM) mätningar av pepparrotperoxidas (HRP) upptag av blåsor. Slutligen, vi övervakas bildandet av nerv terminal membran gropar vid olika tidpunkter efter höga kalium-inducerad depolarisation. Tidsförloppet för HRP upptag och membran grop bildas anger tidsförloppet för endocytos.
Introduction
Neurotransmittorer lagras i synaptiska vesikler och släppt genom exocytos. Den synaptiska vesikler membran protein är sedan internaliseras genom endocytos och återanvändas i nästa omgång av exocytos. Endocytos av synaptiska vesikler är viktiga för att upprätthålla synaptiskt vesikelprotein pooler och tar bort utskjutande blåsor plasmamembranet. Den pH-känsliga grönt fluorescerande protein pHluorin, som härdas under sura förhållanden och dequenched i neutralt pH, har använts för att mäta endocytos tid kurser i levande celler1,2,3. Proteinet pHluorin är normalt kopplad till den lumenal sidan av synaptiska vesikelproteinet proteiner, såsom synaptophysin eller VAMP2/synaptobrevin. I vila, är pHluorin härdas i 5,5 pH lumen av synaptiska vesikler. Vesikler fusion till plasmamembranet exponerar vesikulär lumen till extracellulära lösningen där pH är ~ 7.3, vilket resulterar i en ökning pHluorin fluorescens. Efter exocytos, ökad fluorescensen sönderfaller, på grund av endocytos av synaptiska vesikelproteinet proteiner följt av vesikler re försurning inom dessa återvunna blåsor. Även om sönderfallet återspeglar både endocytos och vesikulär re försurning, återspeglar det mestadels endocytos, eftersom förnyad försurning är snabbare än endocytos i de flesta villkor1,4. Tidskonstanten re försurning är 3-4 s eller mindre5,6, som är i allmänhet snabbare än 10 s eller mer krävs för vesikler endocytos4,5. Om experiment behövs för att särskilja endocytos från Re försurning, kan sura släcka experiment med hjälp av 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) lösning (25 mM) med ett pH på 5,5 användas att avgöra huruvida synaptiskt vesikelprotein proteiner är Hämtad från plasmamembranet via endocytos1,3,4. Således pHluorin fluorescens intensitet ökningen speglar en balans av exo- och endocytos, och minskningen efter nervstimulering specifikt återspeglar endocytos.
pHluorin imaging kan användas inte bara för att mäta tid kursen av endocytos, men även storleken på synaptiskt vesikelprotein pool7,8, och sannolikheten för evoked release och spontana släppa9. Många faktorer och proteiner involverade i regleringen av endocytos, såsom kalcium, lösliga NSF-attachment protein receptor (SNARA) proteiner, hjärnan som härrör neurotrofa factor(BDNF) och kalcineurinhämmare har identifierats med hjälp av pHluorin imaging1 , 2 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16. Dessutom frisättning av signalsubstansen kunde detekteras i inte bara primära nervceller men i neuroblastomceller med TIRFM17. Nyligen, pHluorin varianter, dsRed, mOrange och pHTomato har utvecklats för att övervaka samtidiga inspelningar av flera faktorer i en enda synaps18,19. Exempelvis har pHTomato smält med synaptophysin och används med en genetiskt kodade kalcium indikator (GCaMP5K) för att övervaka presynaptiska vesikler fusion och Ca2 + tillströmning i postsynaptiska fack20. PHluorin bifogas synaptic proteiner ger därför en användbar metod för att analysera förhållandet mellan endocytos och exocytos.
EM är en annan metod som vanligen används för att studera endocytos, på grund av den hög rumslig upplösning som visar ultrastrukturella ändringar under endocytos. Två allmänna områden är förmågan att visualisera patologiska förändringar inom neuronala celler21 och spåra vesikler proteiner22. I synnerhet observationen av synaptiska vesikelproteinet upptag, membran krökning belagd med clathrin i den periactive zonen, och endosomal strukturer är möjligt med EM3,23,24,25 ,26,27,28. Även EM innebär potentiella artefakter som fixativ-inducerad missbildningar, som kan påverka endocytos och dataanalys är arbetsintensivt, resolutionen ger en attraktiv möjlighet att visualisera cellstruktur. Potentiella fixativ problem och begränsningar i EM temporal upplösning kan övervinnas genom högt tryck frysning, vilket ger en snabb och icke-kemiska metod att stabilisera de känsliga strukturerna som är närvarande under endocytos27.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här visar vi två metoder för att övervaka synaptiskt vesikelprotein endocytos. I den första metoden övervakas vi pHluorin smält med ett synaptiskt vesikelprotein protein i transfekterade nervceller och därefter elektriskt stimuleras. För det andra, vi använde EM avbildning av HRP upptag som induceras av KCl. Vi använde olika stimuli för två skäl. Först hög kalium ansökan framkallar depolarisation av alla nervceller i kulturen. Detta underlättar EM undersökning, med tanke på att vår EM-metod inte kan …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Yong-Ling Zhu för att tillhandahålla synaptophysin-pHluorin2x konstruktion och Dr James E. Rothman för att ge VAMP2-phluorin. Vi tackar Dr. Susan Cheng och Virginia Crocker NINDS elektronmikroskopi anläggning för deras teknisk support och hjälp. Detta arbete stöddes av det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och Stroke intramurala Research Program i USA och ett bidrag från KRIBB initiativ forskningsprogrammet (koreanska biomedicinsk vetenskapsman Fellowship Program), Korea forskningsinstitut Biovetenskap och bioteknik, Sydkorea.
Materials
| Lipofectamine LTX with Plus | Thermo Fisher | 15338-100 | Transfection of plasmid DNA including synaptophysin or VAMP2-pHluorin |
| neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | Growth medium for neuron, Warm up to 37°C before use |
| B27 | Thermo Fisher | 17504-044 | Gradient for neuronal differentiation |
| Glutamax | Thermo Fisher | 35050-061 | Gradient for neuronal culture |
| Poly-D-Lysine coated coverslip | Neuvitro | GG-25-pdl | Substrate for neuronal growth and imaging of pHluorin |
| Trypsin XI from bovine pancrease | Sigma | T1005 | Neuronal culture-digest hippocampal tissues |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 | Neuronal culture-inhibits viscous cell suspension |
| pulse stimulator | A-M systems | model 2100 | Apply electrical stimulation |
| Slotted bath with field stimulation | Warner Instruments | RC-21BRFS | Apply electrical stimulation |
| stimulus isolation unit | Warner Instruments | SIU102 | Apply electrical stimulation |
| lubricant | Dow corning | 111 | pHluorin imaging-seal with coverslip and imaging chamber, avoid leak from chamber |
| AP5 | Tocris | 3693 | Gradient for normal saline, selective NMDA receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity |
| CNQX | Tocris | 190 | Gradient for normal saline, competitive AMPA/kainate receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity |
| Illuminator | Nikon | C-HGFI | Metal halide light source for pHluorin |
| EMCCD camera | Andor | iXon3 | pHluorin imaging, detect pHluorin fluorescence intensity |
| Inverted microscopy | Nikon | Ti-E | Imaging for synaptophysin or VAMP2 pHluorin transfected cells |
| NIS-Elements AR | Nikon | NIS-Elements Advanced Research | Software for imaging acquisition and analysis |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for imaging analysis and data presentation |
| imaging chamber | Warner Instruments | RC21B | pHluorin imaging, apply field stimulation on living cells |
| poly-l-lysine | Sigma | P4832 | Electron microscopy, substrate for neuronal growth, apply on multiwell plate for 1 h at room temperature then wash with sterilized water 3 times |
| Horseradish peroxidase(HRP) | Sigma | P6782 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by catalyzing DAB in presence hydrogen peroxide, final concentration is 5 mg/mL in normal saline, make fresh before use |
| Na cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | Electron microscopy, buffer for fixatives and washing, final concentration is 0.1 N |
| 3,3′-Diaminobenzidine(DAB) | Sigma | D8001 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles, substrate for HRP, final concentration is 0.5 mg/mL in DDW and filtered, make fresh before use |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | H1009 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by inducing HRP-DAB reaction, final concentration is 0.3% in DDW, make fresh before use |
| glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16365 | Electron microscopy, fixatives, final concentration is 4% in Na-cacodylate buffer, make fresh before use, shake well before to use |
| TEM | JEOL | 200CX | Electron microscopy, imaging of endocytosed vesicles and ultrastructural changes |
| CCD digital camera | AMT | XR-100 | Electron microscopy, capturing images |
| Lead citrate | Leica microsystems | 16707235 | Electron microscopy, grid staining |
References
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nature cell biol. 2 (4), 197-204 (2000).
- Sun, T., Wu, X. S., et al. The role of calcium/calmodulin-activated calcineurin in rapid and slow endocytosis at central synapses. J Neurosci. 30 (35), 11838-11847 (2010).
- Wu, X. -. S. S., Lee, S. H., et al. Actin Is Crucial for All Kinetically Distinguishable Forms of Endocytosis at Synapses. Neuron. 92 (5), 1020-1035 (2016).
- Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51 (6), 773-786 (2006).
- Atluri, P. P., Ryan, T. A. The kinetics of synaptic vesicle reacidification at hippocampal nerve terminals. J Neurosci. 26 (8), 2313-2320 (2006).
- Royle, S. J., Granseth, B., Odermatt, B., Derevier, A., Lagnado, L. Imaging phluorin-based probes at hippocampal synapses. Methods Mol Biol. 457, 293-303 (2008).
- Moulder, K. L., Mennerick, S. Reluctant vesicles contribute to the total readily releasable pool in glutamatergic hippocampal neurons. J Neurosci. 25 (15), 3842-3850 (2005).
- Li, Z., Burrone, J., Tyler, W. J., Hartman, K. N., Albeanu, D. F., Murthy, V. N. Synaptic vesicle recycling studied in transgenic mice expressing synaptopHluorin. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (17), 6131-6136 (2005).
- Morris, R. G. Elements of a neurobiological theory of hippocampal function: the role of synaptic plasticity, synaptic tagging and schemas. Eur J Neurosci. 23 (11), 2829-2846 (2006).
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Calcium accelerates endocytosis of vSNAREs at hippocampal synapses. Nat Neurosci. 4 (2), 129-136 (2001).
- Balaji, J., Armbruster, M., Ryan, T. A. Calcium control of endocytic capacity at a CNS synapse. J Neurosci. 28 (26), 6742-6749 (2008).
- Ferguson, S. M., Brasnjo, G., et al. A selective activity-dependent requirement for dynamin 1 in synaptic vesicle endocytosis. Science. 316 (5824), 570-574 (2007).
- Baydyuk, M., Wu, X. S., He, L., Wu, L. G. Brain-derived neurotrophic factor inhibits calcium channel activation, exocytosis, and endocytosis at a central nerve terminal. J Neurosci. 35 (11), 4676-4682 (2015).
- Wu, X. S., Zhang, Z., Zhao, W. D., Wang, D., Luo, F., Wu, L. G. Calcineurin is universally involved in vesicle endocytosis at neuronal and nonneuronal secretory cells. Cell Rep. 7 (4), 982-988 (2014).
- Zhang, Z., Wang, D., et al. The SNARE proteins SNAP25 and synaptobrevin are involved in endocytosis at hippocampal synapses. J Neurosci. 33 (21), 9169-9175 (2013).
- Wu, L. -. G. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annu Rev Physiol. 76 (1), 301-331 (2014).
- Daniele, F., Di Cairano, E. S., Moretti, S., Piccoli, G., Perego, C. TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in SH-SY5Y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis. J Vis Exp. (95), e52267 (2015).
- Shaner, N. C., Lin, M. Z., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (6), 545-551 (2008).
- Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat Neurosci. 15 (7), 1047-1053 (2012).
- Leitz, J., Kavalali, E. T. Fast retrieval and autonomous regulation of single spontaneously recycling synaptic vesicles. Elife. 3, e03658 (2014).
- Bisht, K., El Hajj, H., Savage, J. C., Sánchez, M. G., Tremblay, M. -. &. #. 2. 0. 0. ;. Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with β-Amyloid Plaques. J Vis Exp. (112), e54060 (2016).
- Schikorski, T. Monitoring Synaptic Vesicle Protein Sorting with Enhanced Horseradish Peroxidase in the Electron Microscope. High-Resolution Imaging of Cellular Proteins: Methods and Protocols. , 327-341 (2016).
- Kononenko, N. L., Puchkov, D., et al. Clathrin/AP-2 mediate synaptic vesicle reformation from endosome-like vacuoles but are not essential for membrane retrieval at central synapses. Neuron. 82 (5), 981-988 (2014).
- Wu, Y., O’Toole, E. T., et al. A dynamin 1-, dynamin 3- and clathrin-independent pathway of synaptic vesicle recycling mediated by bulk endocytosis. eLife. 2014 (3), e01621 (2014).
- Heuser, J. E., Reese, T. S. Evidence for recycling of synaptic vesicle membrane during transmitter release at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol. 57 (2), 315-344 (1973).
- Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Turnover of transmitter and synaptic vesicles at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol. 57 (2), 499-524 (1973).
- Watanabe, S., Rost, B. R., et al. Ultrafast endocytosis at mouse hippocampal synapses. Nature. 504 (7479), 242-247 (2013).
- Watanabe, S., Trimbuch, T., et al. Clathrin regenerates synaptic vesicles from endosomes. Nature. 515 (7526), 228-233 (2014).
- Sankaranarayanan, S., Atluri, P. P., Ryan, T. A. Actin has a molecular scaffolding, not propulsive, role in presynaptic function. Nat Neurosci. 6 (2), 127-135 (2003).
- Zhu, Y., Xu, J., Heinemann, S. F. Two pathways of synaptic vesicle retrieval revealed by single-vesicle imaging. Neuron. 61 (3), 397-411 (2009).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Arnao, M. B. B., Acosta, M., del Rio, J. A. A., García-Cánovas, F. Inactivation of peroxidase by hydrogen peroxide and its protection by a reductant agent. Biochim Biophys Acta. 1038 (1), 85-89 (1990).
- Deák, F., Schoch, S., et al. Synaptobrevin is essential for fast synaptic-vesicle endocytosis. Nat Cell Biol. 6 (11), 1102-1108 (2004).
- Clayton, E. L., Evans, G. J. O., Cousin, M. A. Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation. J Neurosci. 28 (26), 6627-6632 (2008).
- Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nat Neurosci. 17 (1), 10-16 (2014).
- Wienisch, M., Klingauf, J. Vesicular proteins exocytosed and subsequently retrieved by compensatory endocytosis are nonidentical. Nat Neurosci. 9 (8), 1019-1027 (2006).
- Fernández-Alfonso, T., Kwan, R., Ryan, T. A. Synaptic vesicles interchange their membrane proteins with a large surface reservoir during recycling. Neuron. 51 (2), 179-186 (2006).
- Gimber, N., Tadeus, G., Maritzen, T., Schmoranzer, J., Haucke, V. Diffusional spread and confinement of newly exocytosed synaptic vesicle proteins. Nat Commun. 6, 8392 (2015).
- Nicholson-Fish, J. C., Smillie, K. J., Cousin, M. A. Monitoring activity-dependent bulk endocytosis with the genetically-encoded reporter VAMP4-pHluorin. J Neurosci Methods. 266, 1-10 (2016).
- Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nat Protoc. 1 (6), 2970-2978 (2006).
- Wisse, E., Braet, F., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World journal of gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing Photodamage in Live-Cell Microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
- Søndergaard, C. R., Garrett, A. E., et al. Structural artifacts in protein-ligand X-ray structures: implications for the development of docking scoring functions. J Med Chem. 52 (18), 5673-5684 (2009).
