Method Article

PIP-on-a-chip : 단백질 - 포스 포이 노시 티드 상호 작용에 대한 라벨없는 연구

DOI:

10.3791/55869

⸱

July 27th, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Pennsylvania State University, 2Department of Chemistry, The Pennsylvania State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서 우리는 pH 조절에 기반한 라벨없는 방법을 사용하여 단백질 - 포스 포이 노시 티드 상호 작용을 연구하기위한 마이크로 유체 플랫폼의 맥락에서지지 된 지질 이중층을 제시합니다.

Abstract

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수많은 세포 단백질이 막 표면과 상호 작용하여 필수 세포 과정에 영향을줍니다. 이러한 상호 작용은 phosphoinositides (PIPs)의 경우처럼 특정 세포 내 지방화 및 / 또는 활성화를 보장하기 위해 멤브레인 내의 특정 지질 성분을 향하게 할 수 있습니다. PIP와 세포질 PIP 결합 도메인은 세포 생리학에서 그들의 역할을 더 잘 이해하기 위해 광범위하게 연구되어 왔습니다. 우리는 protein-PIP 상호 작용을 연구하기위한 도구로서지지 된 지질 이중층 (SLBs)에 pH 조절 분석을 적용했습니다. 이 연구에서, pH 민감성 ortho- sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine은 protein-PIP 상호 작용을 검출하는 데 사용됩니다. 단백질이 PIP 함유 멤브레인 표면에 결합하면, 계면 전위가 조절되어 ( 즉 , 국소 pH 변화), 프로브의 양성자 화 상태가 변하게됩니다. pH 조절 분석의 성공적인 사용에 대한 사례 연구는 phospholipase C delta1 Pleckstr상동 (PLC-δ1의 PH) 도메인 및 예로서, 포스파티딜 이노시톨 -4,5- 비스 포스페이트 (PI (4,5) P 2)의 상호 작용이다. 이 상호 작용에 대한 겉보기 해리 상수 ( K d, app )는 0.39 ± 0.05 μM이었고 , 다른 것들에 의해 얻어진 K d 값과 유사했다. 이전에 관찰 된 바와 같이, PLC-δ1 PH 도메인은 PI (4,5) P 2 특이 적이며, 포스파티딜 이노시톨 4- 인산염에 대한 약한 결합을 나타내며, 순수한 포스파티딜콜린 SLB에 대한 결합은 보이지 않는다. PIP-on-a-chip 분석은 낮은 샘플 부피 및 리간드 / 수용체 표지 요구 사항이 없지만 작은 및 낮은 친화도 막 상호 작용을 테스트 할 수있는 능력을 포함하되 이에 국한되지 않는 전통적인 PIP 결합 분석보다 유리합니다. 큰 분자 및 개선 된 신호 대 잡음비. 따라서, PIP-on-a-chip 접근법의 사용은 광범위한 막 상호 작용 메커니즘의 해명을 용이하게 할 것이다. 또한이 방법은 잠재적으로세포막과 상호 작용할 수있는 단백질의 능력을 조절하는 치료제를 확인하는데있어

Introduction

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무수한 상호 작용과 생화학 적 과정은 2 차원 유체 막 표면에서 일어난다. 진핵 세포의 멤브레인 - 둘러싸인 세포 기관은 생화학 적 과정과 관련 프로테옴뿐만 아니라 지질 조성에서도 독특합니다. 예외적으로 인지질의 한 종류는 phosphoinositides (PIPs)입니다. 이들이 세포질 리피도미스의 1 %만을 차지한다고 할지라도, 이들은 신호 변환,자가 식욕 (autophagy), 막 인신 매매 (membrane trafficking)에서 중요한 역할을한다. 그 중에서도 1 , 2 , 3 , 4 가 중요하다. 셀룰러 PIP 키나제하여 이노시톨 헤드 그룹의 동적 인산화 일곱 PIP 모노있다 headgroups, 비스 -, 또는 트리스 - (5)의 인산화를 일으킨다. 또한, PIP는 세포막의 세포 내 신원을 정의하고 하나 이상의 포스 포이 노를 함유하는 단백질 / 효소에 대한 특화된 막 도킹 사이트로서 작용한다예를 들어, 도메인을 itide 결합, 플렉스 트린 상 동성 (PH) Phox 동성 (PX)과 epsin N 말단 ....

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Protocol

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1. 유리 커버 슬립 청소

  1. 7x 세척액을 희석하십시오 ( 재료 표 참조) 바닥이 평평한 100mm 붕규산 유리 접시에 탈 이온수로 7 배 희석하고 20 분 동안 레벨 핫 플레이트에서 95 ℃까지 가열하거나 흐린 용액이 투명해질 때까지 .
    참고 : 솔루션이 뜨거울 수 있으므로 신체 상해를 피하려면주의하십시오. 7x 세척액은 헥사 나트륨 [산화 - [산화 (포스 포 네이 토 옥시) 포스 포릴] 옥시 포스 포릴] 포스페이트, 2- (부 톡시에 톡시) 에탄올, 소듐 1,4- 비스 (2- 에틸 헥 옥시) -1,4- 디 옥소 부탄 -2-sulfonate 및 위험하지 않은 첨가물.
  2. 핀셋을 사용하여 알루미늄 염색약에 coverslips (길이 40mm x 너비 22mm x 높이 0.16-0.19mm)를 번갈아 가며 배열하십시오. 서로 닿지 않도록 각 coverslip 사이에 빈 자리를 유지하십시오.
  3. 세척 용액에 커버 슬립을 묻힌 얼룩 랙을 완전히 담그십시오. 커버 슬립을용액을 1 시간 동안 처리 하였다.
    참고 : 물이 증발함에 따라 용액 농도가 변하지 않도록 신선한 탈 이온수를 계속 추가하십시오.
  4. 얼룩 선반을 세척 용액에서 꺼내고 충분한 양의 탈 이온수로 커버 슬립을 씻어서 세제를 제....

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Results

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우리는 PIP-on-a-chip 마이크로 디바이스 ( 그림 1 ) 내에서 PLC-δ1 PH 도메인 -PI (4,5) P 2 상호 작용을 연구하기 위해 pH 변조 분석을 사용했습니다. 상세한 프로토콜을 통해 마이크로 유체 소자 구성 요소를 준비 및 조립하고 소형 단층 소포 (SUV)를 만들고 ( 그림 2 ) 장치 내 SLB를 형성하고 ( 그림 3 ) PIP를 함유 한 SLB에 대한 단백질 결합을 테스트하는 방법을 시연했습니다. 일반적인 SLB 바인딩 실험의 흐름도가 그림 4에 묘사되어 있습니다. pH 조절 분석의 원리는 PH 도메인 -PI (4,5) P 2 결합을 예로 들어 그림 5에.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

각각의 PIP 변이체는 저농도 임에도 불구하고 특정 세포 소기관의 세포질 표면에 존재하며, 세포막 고유의 물리적 구성과 기능적 특이성의 형성에 기여합니다 1 . PIP를의 가장 중요한 용도 중 하나는 특정 세포 내 현지화 및 / 또는 활성화 6, 7을 필요로하는 단백질의 다수에 대한 특정 도킹 플랫폼이다. 세포 생리학 및 질병에서의 역할로 인해, 생체 관련 분야 에서 in vitro에서 protein-PIP 상호 작용을 연구하는 능력이 중요합니다. 본원에 기재된 분석 포맷은 인지질의 혼합물의 존재 하에서, 극성 머리 그룹 및 자연 길이 지방 아실 사슬의 정상적인 제시와 함께, 유체 지질 이중층의 환경에서 단백질 -PIP 상호 작용을 고려할 수있게한다.

이 분석법을 결합하여pH 시스템을 검출 시스템으로 사용하고, S.......

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DS 및 CEC는 부분적으로는 보조금 AI053531 (NIAID, NIH)에 의해 지원되었다. SS 및 PSC는 보조금 N00014-14-1-0792 (ONR)에 의해 지원되었습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Coverslip
Glass Coverslips: 직사각형Fisher Scientific12-544B22 x 40 x 0.16 - 0.19 mm, No. 1 1/2; 붕규산 유리
7X 세척 용액MP Biomedicals976670세제
PYREX 결정화 접시Corning3140-190바닥이 평평한 붕규산 유리 접시; 직경 x 높이 (190 x 100mm); 유통 업체 : VWR (89090-700)
Sentry Xpress 2.0Paragon IndustriesSC-2Kiln
NameCompany카탈로그 번호 Comments
PDMS
Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트다우 코닝4019862폴리디메틸실록산(PDMS); 유통 업체 : Ellsworth Adhesives
PYREX DesiccatorVWR89134-402진공 정격
생검 펀치Harris15110-10Harris Uni-Core; 직경 1.0mm; 플런저가 있는 Miltex 생검 펀치 (Cat. No. 15110-10)은 대안으로 사용할 수 있습니다
NameCompany카탈로그 번호Comments
Device
Plasma Cleaning SystemPlasmaEtchPE25-JW2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 서비스(Krytox Charged)
디지털 핫 플레이트벤치마크H3760-HDenville Scientific을 통해 구매(Cat. 번호 1005640)
서리로 덥은 마이크로 슬라이드VWR48312-003서리로 덥고, 선택되고, 사전 청소됩니다. 스위스 유리로 제작되었습니다. 두께 : 1mm; 치수: 75 x 25mm; GR 144
NameCompany카탈로그 번호Comments
Mold
AutoCADAutodeskv.2016Drafting software for the photomask design
PhotomaskCAD/Art Services해당 없음검은 색 배경과 명확한 기능을 가진 디자인은 CAD / 아트 서비스
실리콘 웨이퍼대학 웨이퍼1575프라임 그레이드, 단면 광택; 100mm (4 인치) 직경; 525 um 두께
SU-8 50MicroChem Corp.N/A네거티브 톤 포토레지스트; 펜실베이니아 주립 나노 가공 시설 자산
SU-8 개발자MicroChem Corp.N/APenn State Nanofabrication Facility Property
NameCompany카탈로그 번호Comments
SUV
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholineAvanti Polar Lipids850457CPOPC
L-&알파;-포스파티딜이노시톨-4-포스페이Avanti 극성 지질840045XPI4P
L-&알파;-포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이Avanti 극성 지질840046XPI(4,5)P2
1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민Avanti 극성 지질850757CPOPE; oSRB-POPE
Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride(혼합 이성질체)ThermoFisher ScientificL-20oSRB-POPE
pH 민감성 형광 지질 프로브(oSRB-POPE)합성N/A사내 합성(Huang D. et al., 2013)
유리 섬광 바이알VWR66022-06520mL 용량
Aquasonic 250DVWRN/A초음파 수조
핵기공 트랙 에칭 멤브레인Whatman110605폴리카보네이트 멤브레인; 직경 : 25mm; 숨구멍 크기: 0.1um; 유통 업체 : Sigma-Aldrich
ChloroformVWRCX1054-6HPLC grade
LIPEX ExtruderTransferra NanosciencesT.001LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder
Viscotek 802 DLSMalvern InstrumentsN / ADynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property
NameCompany카탈로그 번호Comments
Data Analysis
GraphPad PrismGraphPad Softwarev.6데이터 분석을 위한 곡선 맞춤 소프트웨어
NameCompany카탈로그 번호Comments
Optics
Axiovert 200M Epifluorescence microscopeCarl Zeiss MicroscopyN/AMicroscope
AxioCam MRm CameraCarl Zeiss 현미경N/A카메라
X-Cite 120Excelitas TechnologiesN/A광원
Alexa 568 필터 세트Carl Zeiss 현미경N/AEx/EM 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 소프트웨어Carl Zeiss 현미경N/A이미지 처리 소프트웨어
NameCompany 카탈로그 번호Comments
Other
TipsVWR10034-132200 uL 피펫 팁; 단백질 용액을 미세유체 채널 팁에 적용하기 위한 얇고 매끄러운 팁
VWR53509-07010 uL 피펫 팁; 소포 용액을 미세유체 채널에 적용하기 위한 얇고 매끄러운 팁
Orion Star A321 pH 측정기Thermo ScientificSTARA3210pH
측정기 Orion 마이크로 pH 프로브Thermo Scientific8220BNWP마이크로 pH 프로브
N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid)VWRVWRB30487HEPES, Free
Acid Sodium ChlorideVWRBDH8014-2.5KGRNaCl
튜브연합 와이어 및 케이블TFT-200-24 N내경: 0.020-0.026인치(0.051-0.066cm); 벽 두께: 0.010인치(0.025cm); 유연한 폴리테트라플루오로에틸렌 박벽 튜브; 천연 색소
질소 가스 - IndustrialPraxairN/A현지 공급업체
산소 가스 - IndustrialPraxairN/A로컬 공급업체
액체 질소PraxairN/A로컬 공급업체
에 의해 투명 마스크 (5 x 7 인치)에 20k dpi 해상도로 인쇄되었습니다.트 트 합성에 필요에 필요사내

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
  2. Shewan, A., Eastburn, D. J., Mostov, K. Phosphoinositides in cell architecture. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (8), a004796(2011).
  3. Picas, L., ....

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