هنا نقدم طبقة ثنائية الدهون المدعومة في سياق منصة ميكروفلويديك لدراسة التفاعلات البروتين فسفوانوسيتيد باستخدام طريقة خالية من التسمية على أساس التشكيل الرقم الهيدروجيني.
العديد من البروتينات الخلوية تتفاعل مع أسطح الغشاء للتأثير على العمليات الخلوية الأساسية. ويمكن توجيه هذه التفاعلات نحو مكون معين من الدهون داخل غشاء، كما هو الحال في فوسفهوانوسيتيدس (بيبس)، لضمان توطين خلوية محددة و / أو تفعيل. وقد تم دراسة بيبس والنطاقات الخلوية ملزمة بيب على نطاق واسع لفهم أفضل لدورها في علم وظائف الأعضاء الخلوية. طبقنا فحص التشكيل الرقم الهيدروجيني على الطبقات ثنائية الداعم (سلبس) كأداة لدراسة التفاعلات البروتين بيب. في هذه الدراسات، يتم استخدام الرقم الهيدروجيني الحساسة أورثو -Sulforhodamine B مترافق فوسفهاتيديليثانولامين للكشف عن التفاعلات البروتين بيب. عند ربط البروتين إلى سطح غشاء يحتوي على بيب، يتم تشكيل إمكانات بينية ( أي تغيير في درجة الحموضة المحلية)، وتحويل حالة البروتونات من التحقيق. يتم تقديم دراسة حالة من الاستخدام الناجح لفحص التشكيل الرقم الهيدروجيني باستخدام فوسفهوليباس C delta1 بليكسترفي مجال التماثل (بلك-δ1 ف) و فوسفهاتديلينوسيتول 4،5-بيسفوسفهات (بي (4،5) P 2 ) التفاعل كمثال. كان ثابت التفكك الظاهري ( K د، التطبيق ) لهذا التفاعل 0.39 ± 0.05 ميكرومتر، على غرار K د، والقيم التطبيق التي تم الحصول عليها من قبل الآخرين. كما لوحظ سابقا، المجال بلك-δ1 ف هو بي (4،5) P 2 محددة، ويظهر أضعف ملزم نحو فوسفهاتديلينوسيتول 4-فوسفات، وليس ملزمة ل سسبس نقية فوسفاتيديلكولين. المقايسة بيب على رقاقة هو مفيد على المقايسات التقليدية بيب ملزمة، بما في ذلك ولكن لا تقتصر على انخفاض حجم العينة ولا يجند / مستقبلات وضع العلامات المتطلبات، والقدرة على اختبار التفاعلات غشاء عالية والمنخفضة تقارب مع كل من الصغيرة و جزيئات كبيرة، وتحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء. وبناء على ذلك، فإن استخدام نهج بيب على رقاقة أن يسهل توضيح آليات مجموعة واسعة من التفاعلات الغشاء. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون هذا الأسلوب شسيد في تحديد العلاجات التي تعدل قدرة البروتين على التفاعل مع الأغشية.
عدد لا يحصى من التفاعلات والعمليات البيوكيميائية تجري على سطوح غشاء السائل ثنائي الأبعاد. العضيات المغلقة الغشاء في خلايا حقيقيات النواة هي فريدة من نوعها ليس فقط في العمليات البيوكيميائية والبروتيوم المرتبطة بها ولكن أيضا في تكوين الدهون. فئة استثنائية واحدة من الفوسفورية هي فوسفهوانوسيتيدس (بيبس). على الرغم من أنها تشكل 1٪ فقط من الدهون الدهنية الخلوية، فإنها تلعب دورا حاسما في التنبيه إشارة، أوتوفاجي، والغشاء الاتجار، من بين أمور أخرى 1 ، 2 ، 3 ، 4 . يؤدي الفسفرة الديناميكية لمجموعة رأس الإينوسيتول بواسطة كينازات بيب الخلوية إلى ظهور سبعة مجموعات رأسية بيب هي أحادية أو ثنائية أو تريس فوسفهوريلاتد 5 . بالإضافة إلى ذلك، بيبس تحديد الهوية تحت الخلوية من الأغشية وتكون بمثابة مواقع لرسو السفن المتخصصة لالبروتينات / الإنزيمات التي تحتوي على واحد أو أكثر من فوسفهوانوسعلى سبيل المثال، بليكسترين هومولوغي (ف)، فوكس هومولوغي (بس)، و إبسين N- محطة التماثل (إنث) 6 ، 7 . واحدة من أفضل المجالات درس الملزمة بيب هو فوسفهوليباز C (بلك) -δ1 ف المجال الذي يتفاعل على وجه التحديد مع فوسفاتيديلينوسيتول 4،5-بيسفوسفهات (بي (4،5) P 2 ) ضمن نانومولار منخفضة منخفضة تقارب مجموعة ميكرومولار 8 ، 9 ، 10 ، 11 .
وقد تم تطوير مجموعة متنوعة من الطرق الكمية والكمية في المختبر واستخدامها لدراسة آلية، الديناميكا الحرارية، وخصوصية هذه التفاعلات. ومن بين المقايسات الأكثر شيوعا بين بيب الملزمة هي رنين بلاسمون السطحي (سبر)، و كالوريمتري متساوي الحرارة (إيتس)، و التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (نمر)، و فحص الطفو الليبوسومي / الترسيب، و شحم الدهون (شرائط الدهون / شرائط بيب)12 ، 13 . على الرغم من أن هذه تستخدم على نطاق واسع، لديهم جميعا العديد من العيوب. على سبيل المثال، سير، مركز التجارة الدولية، و نمر تتطلب كميات كبيرة من العينة، وأجهزة مكلفة، و / أو الموظفين المدربين 12 ، 13 . بعض أشكال فحص مثل الأجسام المضادة على أساس الدهون-بلوتس الاستفادة من أشكال قابلة للذوبان في الماء من بيبس وتقديمها بطريقة نفيسيولوجيكال 12 ، 14 ، 15 ، 16 . وبالإضافة إلى ذلك، لا يمكن أن تكون الكميات الدهنية كوانتيتاتد موثوق وأنها كثيرا ما أدت إلى ملاحظات إيجابية / سلبية كاذبة 12 ، 17 ، 18 . للتغلب على هذه التحديات وتحسين مجموعة الأدوات الحالية، تم إنشاء طريقة جديدة خالية من التسمية على أساس طبقة ثنائية الدهن المدعومة (سلب) في سياق آم منصة إيكروفليديك، التي تم تطبيقها بنجاح لدراسة التفاعلات البروتين بيب ( الشكل 1 ) 19 .
وتستند الاستراتيجية المستخدمة للكشف عن التفاعلات البروتين بيب على استشعار الرقم الهيدروجيني التشكيل. وهذا ينطوي على صبغ حساسية الرقم الهيدروجيني التي لديها أورثو -Sulfourhodamine B ( س سرب) مترافق مباشرة إلى فوسفاتيديليثانولامين رئيس مجموعة الدهون 20 . س سرب-بوب التحقيق ( الشكل 2A ) هو الفلورسنت للغاية في درجة الحموضة منخفضة ومطفأ في درجة الحموضة عالية مع يكا حوالي 6.7 ضمن 7.5 مول٪ بي (4،5) P 2 – تحتوي على سلبس ( الشكل 5B ). وقد تم استخدام بلك-δ1 نطاق ف على نطاق واسع للتحقق من صحة البروتين-بيب ملزم المنهجيات نظرا لخصوصيتها العالية بي (4،5) P 2 ( الشكل 5A ) 21 ، 22 ،"> 23 ، 24 ، 25 .Hence، نحن السبب في أن المجال بلك-δ1 ف يمكن أن تستخدم لاختبار ملزم ل بي (4،5) P 2 من خلال فحص بيب على رقاقة.و بناء المجال ف (P4.4)، وبالتالي يجذب أوه – أيونات ( الشكل 5C ) عند ربط بي (4،5) P 2 – تحتوي على سلبس، مجال ف يجلب أوه – أيونات إلى سطح الغشاء، والذي بدوره ينظم إمكانية بينية والتحولات الدولة بروتوناتيون من س SRB-البابا (الشكل 5C) 26. ووظيفة من تركيز نطاق PH، تطفأ مضان (الشكل 6A). وأخيرا، فإن البيانات تطبيع هو يصلح ل إيسوثرم ملزمة لتحديد تقارب من ف المجال بي (4،5) P 2 التفاعل ( الشكل 6B ، 6C ). </ P>
في هذه الدراسة، يتم توفير بروتوكول مفصل لأداء البروتين ملزم ل سلب التي تحتوي على بيب داخل منصة ميكروفلويديك. هذا البروتوكول يأخذ القارئ من تجميع جهاز ميكروفلويديك وإعداد حويصلة لتشكيل سلب والبروتين ملزمة. وبالإضافة إلى ذلك، يتم توفير الاتجاهات لتحليل البيانات لاستخراج المعلومات تقارب ل بلك-δ1 ف المجال بي (4،5) التفاعل P 2 .
كل البديل بيب، وإن كان في تركيزات منخفضة، موجود على سطح عصاري خلوي من عضيات محددة حيث أنها تسهم في إنشاء تكوين البدني الفريد والخصوصية الوظيفية للغشاء العضوي 1 . واحدة من أهم استخدامات بيبس هو بمثابة منصة لرسو السفن محددة للعديد من البروتينات التي تتطلب ?…
The authors have nothing to disclose.
دس و سيس، جزئيا، بمنحة AI053531 (نييد، نيه)؛ تم دعم سس و بسك بالمنحة N00014-14-1-0792 (أونر).
Coverslip | |||
Glass Coverslips: Rectangles | Fisher Scientific | 12-544B | 22 x 40 x 0.16 – 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass |
7X Cleaning Solution | MP Biomedicals | 976670 | Detergent |
PYREX Crystallizing Dish | Corning | 3140-190 | Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700) |
Sentry Xpress 2.0 | Paragon Industries | SC-2 | Kiln |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
PDMS | |||
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives |
PYREX Desiccator | VWR | 89134-402 | Vacuum Rated |
Biopsy punch | Harris | 15110-10 | Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Device | |||
Plasma Cleaning System | PlasmaEtch | PE25-JW | 2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged) |
Digital Hot Plate | Benchmark | H3760-H | Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640) |
Frosted Micro Slides | VWR | 48312-003 | Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mold | |||
AutoCAD | Autodesk | v.2016 | Drafting software for the photomask design |
Photomask | CAD/Art Services | N/A | Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services |
Silicone Wafers | University Wafer | 1575 | Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness |
SU-8 50 | MicroChem Corp. | N/A | Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property |
SU-8 Developer | MicroChem Corp. | N/A | Penn State Nanofabrication Facility Property |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
SUV | |||
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850457C | POPC |
L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate | Avanti Polar Lipids | 840045X | PI4P |
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046X | PI(4,5)P2 |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850757C | POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE |
Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers) | ThermoFisher Scientific | L-20 | Required for the synthesis of oSRB-POPE |
pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE) | In-house | N/A | In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013) |
Glass Scintillation Vial | VWR | 66022-065 | 20 mL volume capacity |
Aquasonic 250D | VWR | N/A | Ultrasonic Water Bath |
Nuclepore Track-Etched Membranes | Whatman | 110605 | Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich |
Chloroform | VWR | CX1054-6 | HPLC grade |
LIPEX Extruder | Transferra Nanosciences | T.001 | LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder |
Viscotek 802 DLS | Malvern Instruments | N/A | Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Data Analysis | |||
GraphPad Prism | GraphPad Software | v.6 | Curve-fitting software for data analysis |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscope | |||
Axiovert 200M Epifluorescence Microscope | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Microscope |
AxioCam MRm Camera | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Camera |
X-Cite 120 | Excelitas Technologies | N/A | Light Source |
Alexa 568 Filter Set | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Ex/Em 576/603 nm |
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Image Processing Software |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
기타 | |||
Tips | VWR | 10034-132 | 200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel |
Tips | VWR | 53509-070 | 10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel |
Orion Star A321 pH meter | Thermo Scientific | STARA3210 | pH meter |
Orion micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | micro pH probe |
N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid) | VWR | VWRB30487 | HEPES, Free Acid |
Sodium Chloride | VWR | BDH8014-2.5KGR | NaCl |
Tubing | Allied Wire & Cable | TFT-200-24 N | Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color |
Nitrogen Gas – Industrial | Praxair | N/A | Local Provider |
Oxygen Gas – Industrial | Praxair | N/A | Local Provider |
Liquid Nitrogen | Praxair | N/A | Local Provider |