Här presenterar vi ett stödjande lipid-dubbelskikt i samband med en mikrofluidisk plattform för att studera interaktioner med protein-fosfinositid med en etikettfri metod baserad på pH-modulering.
Många cellulära proteiner interagerar med membranytor för att påverka väsentliga cellulära processer. Dessa interaktioner kan riktas mot en specifik lipidkomponent i ett membran, såsom i fallet med fosfoinositider (PIP), för att säkerställa specifik subcellulär lokalisering och / eller aktivering. PIP och cellulära PIP-bindande domäner har studerats i stor utsträckning för att bättre förstå deras roll i cellfysiologi. Vi tillämpade en pH-moduleringsanalys på stödda lipid-bilayers (SLB) som ett verktyg för att studera protein-PIP-interaktioner. I dessa studier används pH-känslig orto- sulforhodamin B-konjugerad fosfatidyletanolamin för att detektera protein-PIP-interaktioner. Vid bindning av ett protein till en PIP-innehållande membranyta moduleras gränsspotentialen ( dvs förändring i lokalt pH), förskjutning av sondens protoneringstillstånd. En fallstudie av den framgångsrika användningen av pH-moduleringsanalysen presenteras med användning av fosfolipas C delta1 Pleckstri Homologi (PLC-δ1 PH) domän och fosfatidylinositol-4,5-bisfosfat (PI (4,5) P 2) interaktion som ett exempel. Den uppenbara dissociationskonstanten ( Kd, app ) för denna interaktion var 0,39 ± 0,05 pM, liknande Kd, appvärden erhållna av andra. Såsom tidigare observerats, är PLC-δ1 PH-domänen PI (4,5) P 2 specifik, visar svagare bindning mot fosfatidylinositol 4-fosfat, och ingen bindning till rena fosfatidylkolin SLBs. PIP-on-a-chip-analysen är fördelaktig jämfört med traditionella PIP-bindningsanalyser, inkluderande men inte begränsat till lågprovvolym och inga krav på ligand / receptormärkning, förmågan att testa membraninteraktioner med hög och låg affinitet med både små och Stora molekyler och förbättrat signal-brusförhållande. Följaktligen kommer användningen av PIP-on-a-chip-tillvägagångssättet att underlätta belysningen av mekanismer för ett brett spektrum av membraninteraktioner. Dessutom kan denna metod eventuellt vara digSed i identifierande terapier som modulerar proteins förmåga att interagera med membran.
Myriad interaktioner och biokemiska processer sker på tvådimensionellt flytande membranytor. Membran-slutna organeller i eukaryota celler är unika inte bara i biokemiska processer och deras associerade proteom utan även i deras lipidsammansättning. En exceptionell klass av fosfolipider är fosfinositider (PIP). Trots att de bara omfattar 1% av cellulär lipidom spelar de en avgörande roll i signaltransduktion, autofag och membranhandel, bland annat 1 , 2 , 3 , 4 . Dynamisk fosforylering av inositolhuvudgruppen med cellulära PIP-kinaser ger upphov till sju PIP-huvudgrupper som är mono-, bis- eller trisfosforylerade 5 . Dessutom definierar PIP den membranens subcellulära identitet och tjänar som specialiserade membran dockningsställen för proteiner / enzymer innehållande en eller flera fosforinoserItidbindande domäner, till exempel Pleckstrin Homology (PH), Phox Homology (PX) och epsin N-terminal Homology (ENTH) 6 , 7 . En av de bäst studerade PIP-bindande domäner är fosfolipas C (PLC) -δ1 PH-domänen som specifikt interagerar med fosfatidylinositol-4,5-bisfosfat (PI (4,5) P2) inom ett högt nanomolar-låg mikromolära området affinitet 8 , 9 , 10 , 11 .
En rad kvalitativa och kvantitativa in vitro- metoder har utvecklats och använts för att studera mekanismen, termodynamiken och specificiteten av dessa interaktioner. Bland de vanligast använda PIP-bindningsanalyserna är ytplasmonresonans (SPR), isotermisk kalorimetri (ITC), NMR-spektroskopi, NMR-analys, liposomflotation / sedimentationsanalys och lipid-blottar (Fett-Blots / PIP-remsor)12 , 13 . Trots att dessa används i stor utsträckning har de alla många nackdelar. Exempelvis kräver SPR, ITC och NMR stora mängder av prov, dyr instrumentation och / eller utbildad personal 12 , 13 . Vissa analysformat såsom antikroppsbaserade lipidblottar utnyttjar vattenlösliga former av PIP och presenterar dem på ett icke-fysiologiskt sätt 12 , 14 , 15 , 16 . Dessutom kan lipidblots inte kvantifieras på ett tillförlitligt sätt och de har ofta resulterat i falska positiva / negativa observationer 12 , 17 , 18 . För att övervinna dessa utmaningar och förbättra den nuvarande verktygssatsen upprättades en ny etikettfri metod baserad på ett stödjande lipid-dubbelskikt (SLB) i samband med am Mikrofluidisk plattform, som framgångsrikt användes vid studien av protein-PIP-interaktioner ( Figur 1 ) 19 .
Strategin som används för att detektera protein-PIP-interaktioner baseras på pH-moduleringsavkänning. Detta involverar ett pH-känsligt färgämne som har orto- sulforhodamin B ( o SRB) direkt konjugerad till fosfatidyletanolamin lipidhuvudgrupp 20 . O SRB-POPE-sond (Figur 2A) är mycket fluorescerande vid lågt pH och släcktes vid högt pH med ett pKa omkring 6,7 inom 7,5 mol-% PI (4,5) P2-innehållande SLBs (figur 5B). PLC-δ1 PH-domänen har använts i stor utsträckning för att validera protein-PIP-bindande metoder beroende på dess höga specificitet mot PI (4,5) P2 (figur 5A) 21, 22,"> 23, 24, 25 .Hence, resone vi att PLC-δ1 PH-domänen kan användas för att testa dess bindning till PI (4,5) P2 genom PIP-on-a-chip-analys. PH-domänen konstrukt Den används i denna studie har en positiv nettoladdning (pl 8,4), och attraherar därmed OH -. joner (Figur 5C) vid bindning till PI (4,5) P 2 -innehållande SLBs, ger PH-domänen OH – joner till den membranytan, som i sin tur modulerar den interfacial potential och förskjuter protonetillstånd o SRB-POPE (figur 5C) 26. som en funktion av PH-domän koncentrationen, är fluorescensen släckes (figur 6A). Slutligen, är den normaliserade data som passa till en bindande isotermen för att bestämma affiniteten hos PH-domänen-PI (4,5) P 2 interaktion (figur 6B, 6C). </ P>
I denna studie tillhandahålls ett detaljerat protokoll för att utföra proteinbindning till PIP-innehållande SLB i en mikrofluidisk plattform. Detta protokoll tar läsaren från att montera den mikrofluidiska enheten och vesikelpreparatet till SLB-bildning och proteinbindning. Dessutom till riktningar för analys av data extrahera affinitets information för PLC-δ1 PH-domänen-PI (4,5) P 2 interaktion tillhandahålls.
Varje PIP-variant, om än i låga koncentrationer, är närvarande på den cytosoliska ytan av specifika organeller där de bidrar till upprättandet av en unik fysisk sammansättning och funktionell specificitet hos det organella membranet 1 . En av de viktigaste användningarna av PIP är som en specifik dockningsplattform för de många proteiner som kräver specifik subcellulär lokalisering och / eller aktivering 6 , 7 . På grund av…
The authors have nothing to disclose.
DS och CEC stöddes delvis, genom bidrag AI053531 (NIAID, NIH); SS och PSC stöddes av bidrag N00014-14-1-0792 (ONR).
Coverslip | |||
Glass Coverslips: Rectangles | Fisher Scientific | 12-544B | 22 x 40 x 0.16 – 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass |
7X Cleaning Solution | MP Biomedicals | 976670 | Detergent |
PYREX Crystallizing Dish | Corning | 3140-190 | Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700) |
Sentry Xpress 2.0 | Paragon Industries | SC-2 | Kiln |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
PDMS | |||
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives |
PYREX Desiccator | VWR | 89134-402 | Vacuum Rated |
Biopsy punch | Harris | 15110-10 | Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Device | |||
Plasma Cleaning System | PlasmaEtch | PE25-JW | 2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged) |
Digital Hot Plate | Benchmark | H3760-H | Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640) |
Frosted Micro Slides | VWR | 48312-003 | Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mold | |||
AutoCAD | Autodesk | v.2016 | Drafting software for the photomask design |
Photomask | CAD/Art Services | N/A | Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services |
Silicone Wafers | University Wafer | 1575 | Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness |
SU-8 50 | MicroChem Corp. | N/A | Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property |
SU-8 Developer | MicroChem Corp. | N/A | Penn State Nanofabrication Facility Property |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
SUV | |||
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850457C | POPC |
L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate | Avanti Polar Lipids | 840045X | PI4P |
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046X | PI(4,5)P2 |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850757C | POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE |
Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers) | ThermoFisher Scientific | L-20 | Required for the synthesis of oSRB-POPE |
pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE) | In-house | N/A | In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013) |
Glass Scintillation Vial | VWR | 66022-065 | 20 mL volume capacity |
Aquasonic 250D | VWR | N/A | Ultrasonic Water Bath |
Nuclepore Track-Etched Membranes | Whatman | 110605 | Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich |
Chloroform | VWR | CX1054-6 | HPLC grade |
LIPEX Extruder | Transferra Nanosciences | T.001 | LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder |
Viscotek 802 DLS | Malvern Instruments | N/A | Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Data Analysis | |||
GraphPad Prism | GraphPad Software | v.6 | Curve-fitting software for data analysis |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscope | |||
Axiovert 200M Epifluorescence Microscope | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Microscope |
AxioCam MRm Camera | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Camera |
X-Cite 120 | Excelitas Technologies | N/A | Light Source |
Alexa 568 Filter Set | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Ex/Em 576/603 nm |
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Image Processing Software |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
기타 | |||
Tips | VWR | 10034-132 | 200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel |
Tips | VWR | 53509-070 | 10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel |
Orion Star A321 pH meter | Thermo Scientific | STARA3210 | pH meter |
Orion micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | micro pH probe |
N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid) | VWR | VWRB30487 | HEPES, Free Acid |
Sodium Chloride | VWR | BDH8014-2.5KGR | NaCl |
Tubing | Allied Wire & Cable | TFT-200-24 N | Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color |
Nitrogen Gas – Industrial | Praxair | N/A | Local Provider |
Oxygen Gas – Industrial | Praxair | N/A | Local Provider |
Liquid Nitrogen | Praxair | N/A | Local Provider |