여기, 우리는 miRNA의 갭 접합 종속 셔틀 (gap junction-dependent shuttling) 분석을위한 광 표백 (photobleaching) 후 3 차원 형광 복구 (3D-FRAP)의 응용을 기술한다. 일반적으로 적용되는 방법과는 달리, 3D-FRAP은 높은 시공간 해상도로 실시간으로 작은 RNA의 세포 간 전달을 정량화합니다.
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이 논문에서
요약
초록
miRNA 및 siRNA와 같은 작은 안티센스 RNA는 세포 생리학 및 병리학에서 중요한 역할을하며, 또한 여러 질병의 치료에서 치료제로 사용될 수 있습니다. miRNA / siRNA 치료를위한 새롭고 혁신적인 전략의 개발은 근본적인 메커니즘에 대한 광범위한 지식을 기반으로합니다. 최근의 데이터는 작은 RNA가 갭 접합부 (gap junction-dependent) 방식으로 세포들 사이에서 교환 됨으로써 수용 세포에서 유전자 조절 효과를 유도 함을 시사한다. 분자 생물학적 기법과 유동 세포 계측 분석은 일반적으로 miRNA의 세포 간 교환을 연구하는 데 사용됩니다. 그러나, 이러한 방법은 높은 시간 해상도를 제공하지 못하며, 이것은 분자의 갭 접합 플럭스를 연구 할 때 필요하다. 따라서 miRNA / siRNA가 세포 간 신호 전달 분자로서의 영향을 조사하기 위해서는 이러한 작은 RNA를 세포 수준에서 분석 할 수있는 새로운 도구가 필요합니다. 현재의 프로토콜은 ap(3 차원 - FRAP) 현미경 검사 후 3 차원 형광 복구의 plication은 심장 세포 사이의 갭 접합 - 의존적 인 miRNA 분자의 교환을 해명합니다. 중요한 것은,이 간단하고 비 침습적 인 라이브 셀 이미징 접근 방식은 높은 시공간 해상도로 실시간으로 형광 표지 된 작은 RNA의 갭 접합 셔틀 링의 시각화 및 정량화를 허용합니다. 3D-FRAP에서 얻은 데이터는 작은 RNA가 세포 간 네트워크 내에서 신호 분자로 작용하는 세포 간 유전자 조절의 새로운 경로를 확인합니다.
서론
작은 noncoding RNA는 세포 유전자 조절에서 중요한 역할을합니다. 이 분자는 특정 표적 mRNA에 결합하는 20-25 개의 뉴클레오타이드로 이루어져 번역의 막힘 또는 mRNA 분해 1 또는 2를 유도합니다. miRNA와 siRNA와 같은 작은 RNA에 의해 수행되는 유전자 조절 과정은 많은 다른 종에서 발견 된 매우 보전 된 메커니즘입니다 3 . 특히, miRNA 분자는 증식, 분화 및 재생을 포함한 다양한 생리적 과정에 매우 중요합니다. 또한, miRNA 발현의 조절 장애는 많은 병리학 적 장애로 인한 것입니다. 그에 상응하여, miRNA는 진단을위한 바이오 마커 및 유전자 요법을위한 치료제로서 적합하다는 것이 입증되었습니다 6 , 7 .
GJ는 분자량이 1kD 인 분자를 확산 교환 할 수있는 인접한 두 세포의 원형질막에 특화된 단백질 구조입니다. 그들은 조직 발달, 분화, 세포 사멸, 암이나 심혈관 질환과 같은 병리학 적 장애에 중요한 것으로 밝혀졌습니다
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프로토콜
신생아 생쥐가 관련된이 프로토콜의 모든 단계는 Rostock University Medical Center의 동물 관리 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 세포 배양 용 접시의 준비 및 심근 세포 배양 용 배지
- PBS에서 0.1 % 젤라틴으로 세포 배양 플레이트를 코팅하고 37 ° C에서 4 시간 또는 4 ° C 밤새 인큐베이션하십시오. 젤라틴을 제거하고 멸균 층류 공기 흐름 하에서 건조 시키십시오.
- 10 % 태아 소 혈청 (FBS)과 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S)가 보충 된 DMEM 50 ML로 구성된 세포 배양 배지를 준비합니다. 37 ° C로 예열하십시오.
2. 신생아 심근 세포의 분리
- 멸균 가위로 목을 베고 신생아 생쥐 (1 ~ 2 일 된)를 희생시키고 흉골을 따라 가슴을 엽니 다. 포어를 사용하여 가슴을 약간 제거하면서 가슴을 제거하고 심장을 얼음처럼 차가운 HBSS가 들어있는 24-well plate에 옮긴다.(Ca 2+ 및 Mg 2+ 없이).
- 살균 포셉을 사용하여 비 심장 조직 및 큰 혈관을 제거합니다. 얼음처럼 차가운 HBSS가 들어....
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결과
여기, 신생아 cardiomyocytes 이내 형광 miRNA의 간격 junctional 셔틀을 연구 비 침습적 인 기술로 3D - FRAP 현미경을 제시합니다. 분리 된 심근 세포는 전형적으로 흘린 α- 액티 닌 패턴을 나타내었고, 세포 간 경계 ( 그림 1A , 흰 화살촉)를 따라 Cx43의 큰 플라크를 포함하여 분자간의 높은 세포 간 플럭스를 허용했다. 단리 된 심근 세포의 순도는 α-actinin 양성 세포의 현미경 적 정량으로 평가 하였다. 일부 비 - 심근 세포 (α- 악티닌 - 음성 세포)가 배양 물에 존재 하였지만, 신생아의 심근 세포는 분리 후 주요 세포 유형을 나타내었다 (79.62 ± 3.68 %, 도 1B ).
miRNA의 gap j.......
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토론
miRNA는 세포 생리학에서 중요한 역할을 담당하며, 다른 것들 중에서도 GJ를 세포 간 교환을위한 경로 11 , 12 , 22 로 사용함으로써 신호 분자로 작용하는 것으로 나타났습니다. 현재 프로토콜 세포 클러스터 내에서 형광 miRNAs를 사용 하여이 GJ 의존 shuttling을 특성화 하는 체외 라이브 셀 이미징 기술을 제공합니다.
프로토콜은 세포 모델 시스템으로 cardiomyocytes에 개발되었습니다. 그러나, electroporation이 miRNA transfection에 적합한 방법이라면이 접근법은 여러 세포 유형에 적용될 수 있습니다. 세포 간 교환 외에도 제시된 기술은 miRNA 분자의 세포 내 이동성을 조사하는데도 적합합니다 ( 예 : 세포 내에.......
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공개 사항
저자는 아무런 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 연구는 연방 교육 연구부 (FKZ 0312138A 및 FKZ 316159), 유럽 연합 구조 기금 (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 및 ESF / IVBM-B35-0010 / 12), DFG (DA1296-1) 및 독일 심장 재단 (F / 01 / 12). 또한 RD는 Rostock University Medical Center (889001)의 FORUN 프로그램, DAMP Foundation 및 BMBF (VIP + 00240)의 지원을받습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 신생아 NMRI 마우스 | Charles River | ||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | PBS의 0.1% 용액, 멸균 |
| PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
| Dulbecco´ s 변형 배지 | Pan Biotech | P04-03550 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/mL, 100µ g/mL |
| 소 태아 혈청 | Pan Biotech | P30-3306 | |
| 세포 배양 플라스틱 | TPP | ||
| 1차 심근세포 분리 키트 | Thermo Fisher Scientific | 88281 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 88281 | 1차 심근세포 분리 키트에 포함됨 |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| miRIDIAN Dy547 표지 microRNA Mimic | Dharmacon | CP-004500-01-05 | RNAse 자유 수, 원액 20µ에 용해; M |
| 인산나트륨 일염기 | 시그마 | S3139 | |
| 인산나트륨 이염기성 | Carl Roth | T877.2 | |
| 염화칼 | 시그마 | P9333 | |
| 염화마그네슘 | Serva | 28305.01 | |
| 호박산나트륨 | Carl Roth | 3195.1 | |
| 0.05% 트립신/EDTA 용액 | Merck | L2153 | |
| 4-well- 유리 바닥 챔버 슬라이드 | IBIDI | 80827 | 코팅은 0.1% 젤라틴 용액이 포함된 |
| Amaxa Nucleofector II | Lonza | 프로그램 G-009가 전기천공법에 사용되었습니다. | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 시스템 | Zeiss | ||
| Excel 소프트웨어 | Microsoft | ||
| α-actinin 항체 | Abcam | ab9465 | 희석 1:200 |
| Connexin43 항체 | Santa Cruz | sc-9059 | 희석 1:200 |
| 염소 안티 마우스 Alexa 594 항체 | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | 희석 1:300 |
| 염소 anti-rabbit Alexa 488 항체 | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | 희석 1:300 |
| Connexin43 siRNA | Thermo Fisher Scientific | AM16708 ID158724 | 최종 농도 250 nM |
| 근적외선 라이브/데드 셀 염색 키트 | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
| DAPI 핵 염색 | 써모 사이언티픽 | D1306 |
참고문헌
- Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 136 (4), 642-655 (2009).
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature
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재인쇄 및 허가
