माउस प्राथमिक अनुमस्तिष्क granules न्यूरॉन्स में ंयूरॉन मौत और अध कि मॉडलिंग
Summary
इस प्रोटोकॉल 6-7 दिन पुराने पिल्ले, नुकसान और समारोह के अध्ययन के लाभ के लिए CGNs के कुशल transduction से अलग और संवर्धन प्राथमिक माउस सेरेब्रल granules न्यूरॉन्स (CGNs) के लिए एक सरल विधि का वर्णन है, और मॉडलिंग एनएमडीए-प्रेरित न्यूरॉनी excitotoxicity, कम पोटेशियम प्रेरित कोशिका मौत, डीएनए-क्षति, और oxidative तनाव ही संस्कृति मॉडल का उपयोग कर ।
Abstract
अनुमस्तिष्क granules ंयूरॉंस (CGNs) एक सामांय रूप से इस्तेमाल किया ंयूरॉन मॉडल, सेरिबैलम में एक प्रचुर मात्रा में सजातीय जनसंख्या का गठन कर रहे हैं । उनके जंम के बाद विकास, बहुतायत, और पहुंच के प्रकाश में, CGNs ंयूरॉन प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल हैं, जिसमें ंयूरॉन विकास, ंयूरॉंस प्रवास, और शारीरिक न्यूरॉन गतिविधि उत्तेजना । इसके अलावा, CGN संस्कृतियों excitotoxicity और apoptosis सहित कोशिका मृत्यु के विभिंन साधनों का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रदान करते हैं । संस्कृति में एक सप्ताह के भीतर, CGNs एक्सप्रेस N-मिथाइल-D-aspartate (एनएमडीए) रिसेप्टर्स, ंयूरॉन स्वास्थ्य और रोग में कई महत्वपूर्ण कार्यों के साथ एक विशिष्ट ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर । एनएमडीए के कम सांद्रता के अलावा झिल्ली ध्रुवीकरण को कुतर प्राथमिक CGN संस्कृतियों के साथ संयोजन के रूप में शारीरिक न्यूरॉन गतिविधि उत्तेजना मॉडल के लिए इस्तेमाल किया गया है, जबकि एनएमडीए के उच्च सांद्रता के अलावा मॉडल के लिए नियोजित किया जा सकता excitotoxic न्यूरॉन की चोट । यहाँ, अलगाव और संवर्धन की एक विधि 6 दिन पुराने पिल्ले के साथ ही एडिनोवायरस और lentiviruses द्वारा CGNs के आनुवंशिक हेरफेर से CGNs का वर्णन कर रहे हैं । हम भी कैसे एनएमडीए प्रेरित excitotoxicity, कम पोटेशियम प्रेरित apoptosis, oxidative तनाव और इन न्यूरॉन्स के transduction के बाद डीएनए क्षति को उत्तेजित करने पर अनुकूलित प्रोटोकॉल मौजूद ।
Introduction
अनुमस्तिष्क granules ंयूरॉंस (CGNs) अच्छी तरह से संस्कृति में विशेषता है और एक प्रभावी मॉडल के रूप में कार्य किया है के लिए ंयूरॉन मृत्यु और विकास के अध्ययन 1,2,3,4,5, 6. N-मिथाइल-D-aspartate (एनएमडीए) की प्रारंभिक अभिव्यक्ति विट्रो में CGN संस्कृतियों में रिसेप्टर्स उन्हें एनएमडीए प्रेरित संकेत का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल बनाता है. झिल्ली ध्रुवीकरण के साथ संयोजन के रूप में एनएमडीए के साथ इन रिसेप्टर्स के सक्रियकरण मॉडल शारीरिक न्यूरॉन गतिविधि उत्तेजना के लिए प्रयोग किया जाता है, और synaptic प्लास्टिक 7के तंत्र में अनुसंधान के लिए अनुमति दी है,8. इसके विपरीत, पर एनएमडीए ligand द्वारा इन रिसेप्टर्स की उत्तेजना मॉडल excitotoxicity, तीव्र मस्तिष्क क्षति और neurodegenerative रोगों में ंयूरॉन नुकसान का एक प्रमुख तंत्र के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 9. excitotoxicity की प्रेरण के लिए एक तंत्र कम ऑक्सीजन के साथ एटीपी भुखमरी के माध्यम से है, के रूप में तीव्र ंयूरॉन चोट के साथ देखा । यह झिल्ली ध्रुवीकरण और synapse में ग्लूटामेट रिहाई के स्तर को ऊंचा में परिणाम है । इन रिसेप्टर्स के माध्यम से अत्यधिक सीए2 + में ऊंचा ग्लूटामेट परिणाम द्वारा एनएमडीए रिसेप्टर के बाद अधिक उत्तेजना, जो बारी में सीए सहित कई रास्ते सक्रिय करता है2 +-सक्रिय teases, phospholipases, और endonucleases, गंभीर सेलुलर घटकों और कोशिका मृत्यु के अनियंत्रित क्षरण में जिसके परिणामस्वरूप । इसके अतिरिक्त, उच्च intracellular Ca2 + ऑक्सीजन मुक्त कण और mitochondrial क्षति 10,11की पीढ़ी की ओर जाता है ।
जबकि एनएमडीए-प्रेरित न्यूरॉनी excitotoxicity के बाद ंयूरॉन नुकसान के बहुमत कैल्शियम आमद के कारण है और Bax/Bak स्वतंत्र, कोशिका मृत्यु के अन्य तंत्र इस मॉडल से बाहर नहीं किया जा सकता है । दोनों और excitotoxicity के कारण कोशिका मौत की तरह अपोप्तोटिक की उपस्थिति आंशिक रूप से प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) और डीएनए उच्च intracellular Ca की वजह से नुकसान की पीढ़ी के कारण है2 + स्तर 12। डीएनए क्षति अपोप्तोटिक तंत्र के माध्यम से ंयूरॉन मौत में परिणाम, अपोप्तोटिक कोशिका मृत्यु की पहचान के साथ संबद्ध किया जा रहा है, जैसे क्रोमेटिन जनता और अपोप्तोटिक निकायों की उपस्थिति के रूप में । apoptosis की प्रेरण mitochondria से cytochrome सी की रिहाई के माध्यम से मध्यस्थता है, और Bax/Bak oligomerization 13पर निर्भर होना दिखाया गया है । Bax/Bak oligomerization बाहरी mitochondrial झिल्ली में ताकना गठन को बढ़ावा देता है, cytochrome सी रिलीज में जिसके परिणामस्वरूप और समर्थक अपोप्तोटिक नियामकों के सक्रियण के रूप में हल्के कोरोनरी चोट के साथ देखा 14।
ROS के उत्पादन में antioxidants के कम अंतर्जात स्तर के कारण मस्तिष्क में एक महत्वपूर्ण मुद्दा है, बड़ी ऑक्सीजन की आवश्यकता के साथ मिलकर के लिए ंयूरॉंस कार्य 15। जब एक कोरोनरी घटना के संपर्क में, नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेस, नाइट्रिक ऑक्साइड का उत्पादन और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों में वृद्धि 14विनियमित है । ऑक्सीजन कण की वृद्धि की एकाग्रता डीएनए नुकसान में परिणाम और परोक्ष रूप से ऊर्जा भुखमरी का कारण बन सकता है । डीएनए के उच्च स्तर डबल-फंसे टूट पाली adp-ribose पोलीमरेज़-1 (प्प-1), एक युकेरियोटिक क्रोमेटिन-बाउंड प्रोटीन catalyzing से ADP-ribose इकाइयों के हस्तांतरण के लिए जिंमेदार के सक्रियकरण द्वारा उपचारात्मक है+, एक प्रक्रिया को अभिंन डीएनए मरंमत 16। हालांकि, अत्यधिक oxidative तनाव की वजह से नुकसान के साथ, प्प-1 सक्रियण ऊर्जा भुखमरी णड पर वृद्धि हुई नाली के कारण हो सकता है+, oxidative फास्फारिलीकरण के माध्यम से एटीपी उत्पादन के लिए एक आवश्यक सब्सट्रेट । अंत में, oxidative तनाव एक Bax में apoptosis ट्रिगर होगा/Bak निर्भर तरीके से mitochondrial cytochrome सी रिलीज के लिए अग्रणी है, और mitochondrial 17में CGNs पुननिर्माण प्रेरित दिखाया गया है ।
अंत में, CGN संस्कृतियों में पोटेशियम क्लोराइड (KCl) की एकाग्रता में परिवर्तन मॉडल कम पोटेशियम/ 18,19,20मध्यस्थता apoptosis के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । जब कश्मीर के निंन स्तर को उजागर+, CGNs अलग शारीरिक परिवर्तन से गुजरना, दोनों mitochondrial श्वसन और glycogen की कटौती में जिसके परिणामस्वरूप, सेलुलर मांग 21की कमी के लिए जिंमेदार ठहराया, साथ ही साथ के स्तर में कमी नाभिकीय कारक-κB (NFκB) जो शोथ और synaptic संचरण सहित कार्यकलापों को विनियमित करता है 22. यह मॉडल ंयूरॉन विकास के दौरान कोशिका मृत्यु के अध्ययन के लिए विशेष रुचि का है । कम कश्मीर+ पर्यावरण और अधिक निकटता शारीरिक परिस्थितियों जैसा दिखता है, और कोशिका मौत की पहचान का कारण बनता है ंयूरॉन विकास 23के दौरान देखा ।
संक्षेप में, CGNs एक पुराना मॉडल प्रदान करने के लिए ंयूरॉन मौत और अध की अंतर्निहित आणविक तंत्र की जांच । निंनलिखित प्रोटोकॉल अलगाव और CGNs के संवर्धन की अनुमति देगा, अभिव्यक्ति या एक विशेष आनुवंशिक मार्ग के वायरस और न्यूरॉन की चोट और अध कि पतन का प्रतिनिधित्व करने के विभिंन तंत्र के माध्यम से ंयूरॉन मौत की प्रेरण का उपयोग कर के दमन ।
Protocol
यह प्रोटोकॉल उन कार्यविधियों के संशोधनों पर आधारित है जिनका पहले वर्णन किया गया है 18 , 24 , 25 , २६ , २७ . इस प्रोटोक…
Representative Results
Discussion
यहां हम प्राथमिक माउस अनुमस्तिष्क granules न्यूरॉन्स (CGNs), हानि और समारोह के अध्ययन के लाभ के संवर्धन के लिए एक सरल तरीका प्रदान करते हैं, और सेल मौत के विभिंन तंत्र मॉडलिंग । कई कारकों इस प्रक्रिया है जो बंद न?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान कनाडा की परिषद और कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान अनुदान के संस्थानों जे-ए द्वारा समर्थित है ।
Materials
| qPCR lentivitral titration kit | ABM | #LV900 | |
| speedy virus purification solution | ABM | #LV999 | |
| pCMV-dR8.2 | Addgene | #8455 | |
| pCMV-VS.VG | Addgene | #8454 | |
| Distilled water | Gibco | #15230162 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | #25030081 | |
| 35 mm Nunc culture dishes | Gibco | #174913 | |
| PowerUP SYBR green master mix | life technologies | #A25742 | |
| BSA V Solution | Sigma Aldrich | #A-8412 | |
| CaCl2 • 2H2O | Sigma Aldrich | #C-7902 | |
| Camptothecin | Sigma Aldrich | #C-9911 | |
| Chicken Egg White Trypsin Inhibitor | Sigma Aldrich | #10109878001 | |
| Cytosine beta-D-Arabino Furanoside | Sigma Aldrich | #C-1768 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | #G-7528 | |
| DNase1 | Sigma Aldrich | #11284932001 | |
| Eagle-minimal essential medium | Sigma Aldrich | #M-2279 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | #G-5417 | |
| Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | #F-0392 | |
| Hepes Buffer | Sigma Aldrich | #H-0887 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | #216763 | |
| 50 mg/mL Gentamycin | Sigma Aldrich | #G-1397 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | #M-2643 | |
| N-Methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | #M-3262 | |
| Phenol Red Solution | Sigma Aldrich | #P-0290 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich | #T-4549 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| p3000 enhancer reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| KCl | VWR | #CABDH9258 | |
| NaCl | VWR | #CABDH9286 | |
| NaH2PO4H2O | VWR | #CABDH9298 | |
| Poly D-lysine | VWR | #89134-858 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| FBS | Wisent | #080-450 |
References
- Goldowitz, D., Hamre, K. The cells and molecules that make a cerebellum. Trends in Neurosciences. 21 (9), 375-382 (1998).
- Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
- Bilimoria, P. M., Bonni, A. Cultures of cerebellar granule neurons. CSH Protoc. , (2008).
- Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
- Burgoyne, R. D., Cambray-Deakin, M. A. The cellular neurobiology of neuronal development: the cerebellar granule cell. Brain Res. 472 (1), 77-101 (1988).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annu Rev Neurosci. 18, 385-408 (1995).
- Evans, G. J. Synaptic signalling in cerebellar plasticity. Biol Cell. 99 (7), 363-378 (2007).
- Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 496-508 (2012).
- Arundine, M., Tymianski, M. Molecular mechanisms of calcium-dependent neurodegeneration in excitotoxicity. Cell Calcium. 34 (4-5), 325-337 (2003).
- Szydlowska, K., Tymianski, M. Calcium, ischemia and excitotoxicity. Cell Calcium. 47 (2), 122-129 (2010).
- Jahani-Asl, A., Germain, M., Slack, R. S. Mitochondria: joining forces to thwart cell death. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 162-166 (2010).
- Rego, A. C., Oliveira, C. R. Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis: implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Neurochem Res. 28 (10), 1563-1574 (2003).
- Wei, M. C., et al. Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science. 292 (5517), 727-730 (2001).
- Doyle, K. P., Simon, R. P., Stenzel-Poore, M. P. Mechanisms of ischemic brain damage. Neuropharmacology. 55 (3), 310-318 (2008).
- Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262 (5134), 689-695 (1993).
- Cole, K., Perez-Polo, J. R. Neuronal trauma model: in search of Thanatos. Int J Dev Neurosci. 22 (7), 485-496 (2004).
- Cheung, E. C., McBride, H. M., Slack, R. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of neuronal cell death. Apoptosis. 12 (5), 979-992 (2007).
- Jahani-Asl, A., et al. Mitofusin 2 protects cerebellar granule neurons against injury-induced cell death. J Biol Chem. 282 (33), 23788-23798 (2007).
- Gallo, V., Kingsbury, A., Balazs, R., Jorgensen, O. S. The role of depolarization in the survival and differentiation of cerebellar granule cells in culture. J Neurosci. 7 (7), 2203-2213 (1987).
- Miller, T. M., et al. Bax deletion further orders the cell death pathway in cerebellar granule cells and suggests a caspase-independent pathway to cell death. J Cell Biol. 139 (1), 205-217 (1997).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
- Piccioli, P., et al. Inhibition of nuclear factor-kappaB activation induces apoptosis in cerebellar granule cells. J Neurosci Res. 66 (6), 1064-1073 (2001).
- D’Mello, S. R., Galli, C., Ciotti, T., Calissano, P. Induction of apoptosis in cerebellar granule neurons by low potassium: inhibition of death by insulin-like growth factor I and cAMP. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (23), 10989-10993 (1993).
- Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7919-7923 (1982).
- Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
- Jahani-Asl, A., et al. CDK5 phosphorylates DRP1 and drives mitochondrial defects in NMDA-induced neuronal death. Hum Mol Genet. 24 (16), 4573-4583 (2015).
- Jahani-Asl, A., et al. The mitochondrial inner membrane GTPase, optic atrophy 1 (Opa1), restores mitochondrial morphology and promotes neuronal survival following excitotoxicity. J Biol Chem. 286 (6), 4772-4782 (2011).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), (2009).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
- Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).
