המדידה בו זמנית HDAC1 ופעילות HDAC6 הלה תאים באמצעות UHPLC-MS
Summary
השיטה הנוכחית משמש לזיהוי מעכבי isoform ספציפיים של היסטון deacetylases (HDAC) בתאים הלה על ידי ניתוח UHPLC-MS של סובסטרטים מרובים. זוהי שיטה ללא נוגדנים שפותחו כדי לשקף את פעילות HDAC1, HDAC6 החיים בסביבת תא, בניגוד חד-isoform תא ללא מבחני.
Abstract
החיפוש אחר חדש היסטון deacetylase (HDAC) מעכבי היא גוברת ההתעניינות גילוי תרופות. Isoform סלקטיביות באור הזרקורים מאז האישור של romidepsin, מחלקה אני HDAC מעכב טיפול בסרטן, החקירה קליני של מעכבי HDAC6 ספציפיים עבור מיאלומה נפוצה. השיטה הנוכחית משמש כדי לקבוע את פעילות המעכבת של תרכובות מבחן על HDAC1 ועל HDAC6 בתאים. הפעילות isoform נמדד באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית של ביצועים גבוהה במיוחד – ספקטרומטר מסה (UHPLC-MS) ניתוח של סובסטרטים ספציפי מודגרות עם תאים הלה טיפול ללא טיפול. השיטה יש את היתרון של המשקף את הפעילות HDAC אנדוגני של סביבת התא, בניגוד ללא תא הביוכימי מבחני שנערכו על איזופורמים מבודד. יתר על כן, משום שהיא מבוססת על כימות של סובסטרטים סינתטי, השיטה אינה דורשת הכרה נוגדן של חלבונים acetylated אנדוגני. . זה בקלות לצורכי מספר שורות תאים, תהליך אוטומטי. השיטה כבר הוכיח שימושי למצוא את תרכובות סלקטיבית HDAC6 neuroblasts. נציג התוצאות מוצגות כאן עם תקן HDAC מעכבי trichostatin (שאינם ספציפיים), MS275 (HDAC1-ספציפי), tubastatin (HDAC6-ספציפי) באמצעות תאים הלה.
Introduction
HDACs שייך למשפחת אנזימים מסוגלים deacetylate שינויים היסטוניים בתוך מבנה כרומטין. הם גם יש מצעים חלבונים אחרים ציטוזול, ממוקמים תאים תאים שונים. סך של 18 HDAC איזופורמים זוהו עד כה, קשורה עם מספר מנגנונים התא, לרבות ברגולציה של גורמי שעתוק גנים, וכן איתות התא ולהעביר1,2,3,4,5,6,7. מעכבי קטליטי HDAC הופיעו כמו תרופות טיפולית לטיפול בסרטן. רוב מעכבי HDAC כעת אושרה על ידי ה-FDA לטיפול של לימפומה T-cell, מיאלומה נפוצה, הן מעכבי HDAC שאינם ספציפיים, כגון vorinostat (סאהה), belinostat panobinostat8,9. עם זאת, סדרה של תופעות לוואי קושרו עם פאן-מעכבי, החיפוש אחר מולקולות קטנות isoform ספציפי הוא נושא חם בגילוי כימיה, סם מרפא. בהתאם לכך, המחלקה אני romidepsin מעכב סלקטיבי (HDAC1-3 ו- HDAC8) הוא סמים שאושרו כבר10, בעוד HDAC6 ספציפיים מעכבי מהתוואי ניסויים קליניים, עם הגדלת הפוטנציאל הטיפולי מיאלומה11,12,13,14,15.
הקרנת מבחני לאפיין HDAC מעכבי מבוססים על הדגירה של מצע HDAC עם מקור אנזימטי (isoform בודד, תמצית גרעיני או תא lysate). המצע הוא בדרך כלל רצף פפטיד קטן המכיל של שאריות ליזין אצטיל מצמידים fluorophore cleavable (למשל, קומרין), כגון N-(4-methyl-7-aminocoumarinyl)-Nα-(t-butoxycarbonyl)-Nω-acetyllysineamide (MAL)16. כדי להבחין בין פעילויות ספציפיות isoform, נפרד ללא תא מבחני מעורבים כל isoform נחוצים ולא עשוי לשקף את הפעילות isoform אמיתי בתאים חיים. מצעים Isoform ספציפיים זמינים מסחרית, כגון בנזיל (S)-[1-(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)-5-propionylaminopentyl]carbamate (MOCPAC, HDAC1 סובסטרט מסוים), (אסתר טרט חומצה-בוטיל S)-[5-acetylamino-1-(2-oxo-4-trifluoromethyl-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)pentyl]carbamic (BATCP, המצע ספציפי HDAC6) (איור 1B). עם זאת, תערובת מצע מרובה המכילה מאל, MOCPAC, BATCP ניתנה לתאים חיים לא ארשה זיהוי המוצרים deacetylated הבודדים על ידי מדידה fluorometric, נתון כי הם נושאים את אותו fluorophore cleavable.
השיטה המתוארת כאן מאפשר זיהוי, כימות היחסי של כל המצע ואת המוצר שלה deacetylated בתאים הלה שימוש assay המצע מרובה ואחריו ניתוח UHPLC-ESI-MS/MS17. HDAC assay מתנהל על הלה תאים כדי לאפשר זיהוי ישיר של פעילות המעכבת HDAC ושל יחודיות של מבחן והמתחמים HDACs אנדוגני. יש דגש על HDAC1 ו HDAC6, אשר יוערכו בו זמנית. כדי להשיג אלה מידות אנזימטי וזמינותו דגירה יחיד, תערובת של סובסטרטים HDAC שאינם ספציפיים ולא ספציפי מתווסף תאים הלה טיפול ללא טיפול מצופה על צלחת 96-ובכן. בעקבות שלב הדגירה, התאים הם lysed כדי לשחרר את סובסטרטים ומוצרים שלהם התגובה המתאימים, אשר מופרדים וזוהה באמצעות שיטה UHPLC-MS (איור 1C). המוצרים deacetylated של סובסטרטים מל, MOCPAC ו- BATCP הם מל deacetylated (dMAL) deacetylated MOCPAC (dMOCPAC), deacetylated BATCP (dBATCP), בהתאמה. יכול להיות בנוי עקומות מנה-תגובה עם חומרים פעילים.
איור 1: ערכת כללי עבור מבוססת-תא HDAC וזמינותו לזהות מעכבי ספציפיים HDAC1 או HDAC6 על ידי ניתוח UHPLC-MS של סובסטרטים מרובים. בסכמה (A) צלחת 96-ובכן אופייני המכיל מטופלים (מבחן תרכובות), תאים הלה אינו מטופל (שליטה), כמו גם ללא תאים ריקים. (B) המבנה הכימי של סובסטרטים הוסיף תערובת (21 מיקרומטר כל) כדי להיות deacetylated על ידי HDACs אנדוגני. (ג) chromatogram UHPLC טיפוסי-MS מציג את הפסגות של סובסטרטים הוסיף את (MAL, MOCPAC ו BATCP) ומוצרים deacetylated שלהם (dMAL, dMOCPAC, ו- dBACTP, בהתאמה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Protocol
Representative Results
Discussion
עיכוב HDAC הוא נושא חם, גילוי תרופות, תוך התמקדות מעכבי HDAC6 סלקטיבית עבור סרטן טיפול21הנוכחי. HDAC סלקטיביות מוערך בדרך כלל על ידי סדרה של מבחני תפוקה גבוהה, ללא תאים, אשר מתכוון לקבוע את העוצמה מעכבות לכיוון HDAC בודדים איזופורמים21. עם זאת, מידת הבררנות של מעכב יש בנוסף ל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים להכיר עלות פעולה CM1406 (Epigenetic ביולוגיה כימית). מחקר דיווח בפרסום זה נתמך על ידי קרן פייר מרסייה.
Materials
| BATCP | Sigma-Aldrich | B4061 | |
| MAL | Sigma-Aldrich | SCP0168 | Synonym: BOC-Ac-Lys-AMC |
| MOCPAC | Sigma-Aldrich | M2195 | |
| MS275 | Sigma-Aldrich | EPS002 | |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich | T8552 | |
| Tubastatin A | Sigma-Aldrich | SML0044 | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | 10660131 | |
| Formic acid, LC/MS grade | Fisher Scientific | 10596814 | |
| H2O, HPLC grade | distilled H2O filtered through a Milli-Q purification system | ||
| HeLa cells | ATCC | ATCC CRM-CCL-2 | |
| Cell dissociation reagent TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | |
| DMSO, cell culture grade | Applichem | 146463 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1810 | |
| MEM | ThermoFisher Scientific | 22561021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Bioconcept | 4-01F00-H | |
| 10X RIPA buffer | Abcam | ab156034 | |
| SigmaFast protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| 96-well plates, sterile, flat-bottom, tissue culture treated Corning | VWR | 29442-058 | |
| 96-well plates, non-sterile, V-bottom Corning | VWR | 29442-404 | used in the centrifugation step |
| 96-well plate, conical bottom, Nunc | ThermoFisher Scientific | 249944 | compatible with the Acquity UHPLC system |
| T75 cell culture flasks Corning | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| Peelable heat sealing foil | Waters | 186002789 | |
| Acquity UPLC system | Waters | ||
| Eppendorf Centrifuge 5810 R | Fisher Scientific | 05-413-323 | |
| Integration software: MassLynx V4.1 | Waters | Catalog number not available | |
| Combi thermo-sealer SP-0669/240 | Waters | Catalog number not available | |
| Quattro micro API Tandem Quadrupole System | Waters | Catalog number not available |
References
- Arrowsmith, C. H., Bountra, C., Fish, P. V., Lee, K., Schapira, M. Epigenetic protein families: a new frontier for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 11 (5), 384-400 (2012).
- Henikoff, S., Greally, J. M. Epigenetics, cellular memory and gene regulation. Curr Biol. 26 (14), R644-R648 (2016).
- Kim, C., et al. HDAC6 inhibitor blocks amyloid beta-induced impairment of mitochondrial transport in hippocampal neurons. PLoS One. 7 (8), (2012).
- Kawaguchi, Y., et al. The deacetylase HDAC6 regulates aggresome formation and cell viability in response to misfolded protein stress. Cell. 115 (6), 727-738 (2003).
- Zhao, Y., et al. Acetylation of p53 at lysine 373/382 by the histone deacetylase inhibitor depsipeptide induces expression of p21(Waf1/Cip1). Mol Cell Biol. 26 (7), 2782-2790 (2006).
- Berger, S. L. Histone modifications in transcriptional regulation. Curr Opin Genet Dev. 12 (2), 142-148 (2002).
- Simões-Pires, C., et al. HDAC6 as a target for neurodegenerative diseases: what makes it different from the other HDACs?. Mol Neurodegener. 8 (7), 1-16 (2013).
- Mottamal, M., Zheng, S., Huang, T. L., Wang, G. Histone deacetylase inhibitors in clinical studies as templates for new anticancer agents. Molecules. 20 (3), 3898-3941 (2015).
- Manal, M., Chandrasekar, M. J., Gomathi Priya, J., Nanjan, M. J. Inhibitors of histone deacetylase as antitumor agents: A critical review. Bioorg Chem. 67, 18-42 (2016).
- Mack, G. S. To selectivity and beyond. Nat Biotech. 28 (12), 1259-1266 (2010).
- . Study of ACY-1215 alone and in combination with bortezomib and dexamethasone in multiple myeloma (ACY-1215) Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01323751 (1211)
- . Study of ACY-1215 in combination with lenalidomide, and dexamethasone in multiple myeloma Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01583283 (2012)
- . 13ACY-1215 (ricolinostat) in combination with pomalidomide and low-dose dex in relapsed-and-refractory multiple myeloma Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01997840 (2013)
- . Study of ACY-241 alone and in combination with pomalidomide and dexamethasone in multiple myeloma Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02400242 (2015)
- Yee, A. J., et al. Ricolinostat plus lenalidomide, and dexamethasone in relapsed or refractory multiple myeloma: a multicentre phase 1b trial. Lancet Oncol. 17 (11), 1569-1578 (2016).
- Jung, M. Homogenous non-isotopic assays for histone deacetylase activity. Expert Opin Ther Pat. 13 (6), 935 (2003).
- Zwick, V., Simões-Pires, C., Cuendet, M. Cell-based multi-substrate assay coupled to UHPLC-ESI-MS/MS for a quick identification of class-specific HDAC inhibitors. J Enzyme Inhibi Med Chem. 31 (1), 209-214 (2016).
- Khan, N., et al. Determination of the class and isoform selectivity of small-molecule histone deacetylase inhibitors. Biochem J. 409 (2), 581-589 (2008).
- Glaser, K. B., et al. Differential protein acetylation induced by novel histone deacetylase inhibitors. Biochem Biophys Res Commun. 325 (3), 683-690 (2004).
- Butler, K. V., et al. Rational design and simple chemistry yield a superior, neuroprotective HDAC6 inhibitor, tubastatin A. J Am Chem Soc. 132 (31), 10842-10846 (2010).
- Jung, M., Yong, K. -. J., Velena, A., Lee, S., Sippl, W., Jung, M. Cell-Based Assays for HDAC Inhibitor Hit Validation. Epigenetic Targets in Drug Discovery. , (2010).
- Milli, A., et al. Proteomic analysis of cellular response to novel proapoptotic agents related to atypical retinoids in human IGROV-1 ovarian carcinoma cells. J Proteome Res. 10 (3), 1191-1207 (2011).
- Zwick, V., et al. Synthesis of a selective HDAC6 inhibitor active in neuroblasts. Bioorg Med Chem Lett. 26 (20), 4955-4959 (2016).
- Ciossek, T., Julius, H., Wieland, H., Maier, T., Beckers, T. A homogeneous cellular histone deacetylase assay suitable for compound profiling and robotic screening. Anal Biochem. 372 (1), 72-81 (2008).
- Heltweg, B., Dequiedt, F., Marshall, B. L., Brauch, C., Yoshida, M., et al. Subtype selective substrates for histone deacetylases. J Med Chem. 47 (21), 5235-5243 (2004).
- Copeland, R. A. . Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery. , (2005).
