헬러의 HDAC1 및 HDAC6의 동시 측정 셀 사용 하 여 UHPLC MS
Summary
현재 메서드 여러 기판의 UHPLC MS 분석에 의해 HeLa 세포에서 히스톤 deacetylases (HDAC)의 isoform 특정 억제제를 식별 하는 역할. 이것은 생활에서 HDAC1 및 HDAC6 활동을 반영 하기 위해 개발 된 항 체 없는 메서드를 단일 isoform 셀 무료 분석 달리 셀 환경.
Abstract
새로운 히스톤 deacetylase (HDAC) 억제제에 대 한 검색 증가 약물 발견에 대 한 관심입니다. Isoform 선택 romidepsin, 클래스의 승인부터 스포트 라이트에서 되었습니다 내가 HDAC 억제제 암 치료, 그리고 여러 발성에 대 한 HDAC6 전용 억제제의 임상 조사에 대 한. 현재 메서드는 HDAC1 및 HDAC6 셀에 테스트의 금지 활동을 결정 하는 데 사용 됩니다. Isoform 활동 초 고성능 액체 크로마토그래피-질량 분석 (MS UHPLC) 분석의 특정 기판 처리와 치료 HeLa 세포와 알을 품을 사용 하 여 측정 됩니다. 메서드는 환경 내에서 셀 셀 무료 생 화 확 적인 분석 실험 격리 isoforms에 달리 생 HDAC 활동 반영의 이점이 있다. 또한, 합성 기판의 정량화에 기반 하기 때문에 메서드는 생 acetylated 단백질의 항 체 인식이 필요 하지 않습니다. 그것은 쉽게 여러 셀 라인 및 자동화 된 프로세스에 적응입니다. 메서드는 이미 neuroblasts에서 HDAC6-선택적 화합물을 찾는 유용한 증명 했다. 대표 결과 표준 HDAC 억제제 trichostatin는 (일반적인), MS275 이전으로 여기에 표시 됩니다 (HDAC1 전용), 및 tubastatin (HDAC6-특정) 헬러 세포를 사용 하 여.
Introduction
HDACs 효소 chromatin 구조 내에서 히스톤 deacetylate 수의 가족에 속한다. 그들은 또한 다른 단백질 기판은 cytosol에서 있고 다양 한 셀 구획에 있습니다. 18 HDAC isoforms의 총 세포 신호 뿐만 아니라 녹음 방송 요인 유전자 발현의 규칙을 포함 하 여 몇 가지 셀 메커니즘에 관련 된 고1,2,3,,45,,67수송 지금까지 확인 된. HDAC 촉매 억제제는 암 치료에 대 한 잠재적인 치료 약물으로 떠오르고 있다. 현재 FDA에 의해 승인 대부분 HDAC 억제제 T-세포 림프 종 및 다 발성의 치료에 대 한 되며 vorinostat (사), belinostat, panobinostat,89등 일반적인 HDAC 저 해제. 그러나, 부작용의 시리즈 팬-억제제, 연관 된 고 isoform 특정 작은 분자에 대 한 검색의 약 화학과 약물 발견에 뜨거운 주제입니다. 따라서, 클래스 I (HDAC1-3와 HDAC8) 선택적 억제제 romidepsin는 이미 승인 된 약10, HDAC6 특정 억제제는 현재 임상 시험, 다중 골 수 종11,12,13,,1415에 증가 치료 잠재력.
HDAC 특성 분석 실험 심사 억제제 (단일 isoform, 핵 추출 물, 또는 세포 lysate) 효소 소스와 HDAC 기판의 외피에 근거한 다. 기판은 일반적으로 N-(4-methyl-7-aminocoumarinyl)-Nα-(t-butoxycarbonyl)-Nω-acetyllysineamide (말)16등 쪼갤 fluorophore (예: coumarin), 결합 틸 리 진 잔류물을 포함 하는 작은 펩 티 드 순서. Isoform 특정 활동을 구분 하기 위해 각 isoform를 포함 하는 별도 셀 무료 분석 필요 하 고 살아있는 세포에서 진짜 isoform 활동을 반영 하지 않을 수도 있습니다. Isoform 특정 기판 벤 질 등 상업적으로 사용할 수 있습니다 (S)-[1-(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)-5-propionylaminopentyl]carbamate (MOCPAC, HDAC1 특정 기판)와 (S)-[5-acetylamino-1-(2-oxo-4-trifluoromethyl-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)pentyl]carbamic 산 tert-부 틸 에스테 르 (BATCP, HDAC6 특정 기판) (그림 1B). 그러나, 말을 포함 하는 다중 기판 혼합물, MOCPAC, 및 BATCP 살아있는 세포에 게 주어진 것입니다 허용 하지 개별 deacetylated 제품의 탐지 fluorometric 측정에 의해 그들은 동일한 쪼갤 fluorophore를 품는.
여기 설명 하는 방법을 검색 및 각 기판 및 UHPLC-ESI-MS/MS 분석17다음 멀티 기판 분석 결과 사용 하 여 헬러 세포에 그것의 deacetylated 제품의 상대적 정량화 할 수 있습니다. HDAC 분석 결과 HDAC 억제 활동의 및 내 인 성 HDACs에 시험 화합물의 특이성의 직접 식별 수 있도록 HeLa 세포에 실시 됩니다. 동시에 평가 되는 HDAC1 및 HDAC6에 초점이 이다. 위해 단일 외피 분석 결과에서 이러한 효소 측정, 비 및 특정 HDAC 기판의 혼합물 96 잘 접시에 도금 처리와 치료 HeLa 세포에 추가 됩니다. 인큐베이션 단계 세포는 기질 및 그들의 각각 반응 제품을 구분 되 고 UHPLC MS 메서드 (그림 1C)을 사용 하 여 검출 하 lysed 됩니다. 말, MOCPAC, 및 BATCP 기판의 deacetylated 제품 이다 deacetylated 말 (dMAL), deacetylated MOCPAC (dMOCPAC), 그리고 deacetylated BATCP (dBATCP), 각각. 복용량 응답 곡선 활성 화합물으로 만들 수 있습니다.
그림 1: 여러 기판의 UHPLC MS 분석에 의해 HDAC1 및 HDAC6 관련 억제제를 식별 하기 위해 셀 기반 HDAC 분석 결과 대 한 일반적인 구성표. 전형적인 96 잘 접시 포함 하는 치료 (시험 화합물)의 (A) 체계 및 치료 (제어) 헬러 세포 뿐 아니라 셀 무료 공백. (B) 기판 내 생 HDACs에 의해 deacetylated 혼합 (21 µ M 각)으로 추가의 화학 구조. (C) 추가 기판 (말, MOCPAC, 및 BATCP) 및 그들의 deacetylated 제품의 봉우리를 보여주는 전형적인 UHPLC-MS 크로마 (dMAL, dMOCPAC, 그리고 dBACTP, 각각). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
HDAC 저해 약물 발견, 암 치료21HDAC6-선택적 억제제에 현재 초점에서 뜨거운 주제입니다. HDAC 선택도 일반적으로 개별 HDAC isoforms21으로 억제 효능을 결정 하는 높은 처리량, 셀 무료 분석 실험의 시리즈에 의해 평가 됩니다. 그러나, 억제제의 선택도 확인 되어야 합니다 또한 살아있는 세포에서 히스톤과 같은 내 생 단백질 기판의 acetylation 상태를 평가 하 여 (에 대 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 인정 비용 작업 CM1406 (Epigenetic 화학 생물학). 이 간행물에 보고 된 연구 피에르 메 르 시 재단에 의해 지원 되었다.
Materials
| BATCP | Sigma-Aldrich | B4061 | |
| MAL | Sigma-Aldrich | SCP0168 | Synonym: BOC-Ac-Lys-AMC |
| MOCPAC | Sigma-Aldrich | M2195 | |
| MS275 | Sigma-Aldrich | EPS002 | |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich | T8552 | |
| Tubastatin A | Sigma-Aldrich | SML0044 | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | 10660131 | |
| Formic acid, LC/MS grade | Fisher Scientific | 10596814 | |
| H2O, HPLC grade | distilled H2O filtered through a Milli-Q purification system | ||
| HeLa cells | ATCC | ATCC CRM-CCL-2 | |
| Cell dissociation reagent TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | |
| DMSO, cell culture grade | Applichem | 146463 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1810 | |
| MEM | ThermoFisher Scientific | 22561021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Bioconcept | 4-01F00-H | |
| 10X RIPA buffer | Abcam | ab156034 | |
| SigmaFast protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| 96-well plates, sterile, flat-bottom, tissue culture treated Corning | VWR | 29442-058 | |
| 96-well plates, non-sterile, V-bottom Corning | VWR | 29442-404 | used in the centrifugation step |
| 96-well plate, conical bottom, Nunc | ThermoFisher Scientific | 249944 | compatible with the Acquity UHPLC system |
| T75 cell culture flasks Corning | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| Peelable heat sealing foil | Waters | 186002789 | |
| Acquity UPLC system | Waters | ||
| Eppendorf Centrifuge 5810 R | Fisher Scientific | 05-413-323 | |
| Integration software: MassLynx V4.1 | Waters | Catalog number not available | |
| Combi thermo-sealer SP-0669/240 | Waters | Catalog number not available | |
| Quattro micro API Tandem Quadrupole System | Waters | Catalog number not available |
References
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