تحديد وتوصيف العوامل المنتشر بنقل الجينات في رواية التمزق--الوسم؛ مزق--tva النموذجي مورين
Summary
نقدم بروتوكولا لإثبات نظام نقل جينات جسدية رواية استخدام التمزق–الوسم؛ مزق–tva طراز الماوس لدراسة وظيفة الجينات في ورم خبيث. يتم تسليم الفيروسات القهقرية إنفلونزا الطيور إينتراكاردياكالي لضمان نقل الجينات إلى آفات ما قبل الخبيثة، noninvasive الخلايا β البنكرياس في الفئران الكبار.
Abstract
السرطان المنتشر تمثل 90 في المائة من الوفيات في المرضى الذين يعانون من الأورام الصلبة. وهناك حاجة ملحة لفهم القوى المحركة لسرطان خبيث وتحديد الأهداف العلاجية الرواية. للتحقيق في الأحداث الجزيئية التي تدفع التدرج من السرطان الابتدائي لورم خبيث، قمنا بتطوير نموذج ماوس بيترانسجينيك، التمزق–الوسم؛ مزق–tva. في هذا الطراز الماوس، محركات المروج الأنسولين الفئران (RIP) التعبير عن مستضد SV40 تي (العلامة) والمستقبلات للفريق الفرعي المعني بفيروس إنفلونزا الطيور ليوكوسيس (tva) في خلايا بيتا في البنكرياس. وضع الفئران أورام الغدد الصم العصبية البنكرياس مع بينيترانسي 100% من خلال مراحل محددة تحديداً جيدا التي تشبه tumorigenesis البشرية، مع المراحل بما في ذلك تضخم والأوعية، والورم الحميد، وسرطان الغازية. لأن التمزق–الوسم؛ مزق–tva الفئران لا تتطور المرض المنتشر، التعديلات الوراثية التي تروج لورم خبيث يمكن تحديدها بسهولة. نقل الجينات الجسدية إلى الإعراب عن tva، تنتشر β البنكرياس والآفات بريماليجنانت يتحقق من خلال حقن intracardiac الجزيئي إنفلونزا الطيور التي تأوي التعديلات الوراثية المرغوبة. عيار من > 1 × 108 وحدات المعدية كل مل يعتبر مناسباً للعدوى في الجسم الحي . وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تصيب الفيروسات القهقرية إنفلونزا الطيور خطوط الخلايا المستمدة من الأورام في التمزق–الوسم؛ مزق–tva الفئران بكفاءة عالية. يمكن أيضا استخدام خطوط الخلايا لوصف العوامل المنتشر. هنا نحن لشرح كيفية الاستفادة من هذا الطراز الماوس وخلية خطوط لتقييم وظائف الجينات المرشحة في ورم خبيث.
Introduction
وتنشأ معظم حالات السرطان من طفرات جسمية 1. نماذج الماوس المهندسة وراثيا التقليدية (جيمم) قدمت أفكاراً هامة في مساهمة محددة التعديلات الوراثية إلى توموريجينيسيس 2. ومع ذلك، لديهم العديد من القيود. العيب الرئيسي لهذه النماذج هو أنها لا تكرر متفرقة طبيعة تشكيل الأورام في البشر، والذي يكتسب فقط بعض الخلايا داخل أنسجة التعديلات الوراثية. الطفرات في الفئران المحورة وراثيا والضربة القاضية هي أيضا germline مع احتمال أن تؤثر على التنمية. وعلاوة على ذلك، تولد هذه النماذج الماوس مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً.
ورم خبيث قضية هامة في مجال السرطان. النمذجة خبيث كان صعباً في جيم. ومن النادر خبيث عفوية في الماوس. بينيترانسي متغير والكمون الطويل في جيمم لورم خبيث 3. نماذج تجريبية خبيث تستخدم الحقن المباشر من الخلايا إلى الدورة الدموية للفئران، حتى يتم القضاء على الخطوات المبكرة في تتالي المنتشر.
للتغلب على بعض أوجه القصور المذكورة أعلاه في دراسة العوامل المنتشر في نماذج الماوس، قمنا بتطوير نموذج ماوس بيترانسجينيك، التمزق–الوسم؛ مزق–tva4. ترتكز الاستراتيجية على الجمع بين استخدام ورم متزامنة عالية تقدم ماوس نموذج، التمزق، العلامة 5، والمستقبلات فيروس leukosis الفريق الفرعي المعني بإنفلونزا الطيور، tva 6،7. هذا التمزق -الوسم؛ مزق–tvaيسمح طراز الماوس الجينات إدخال سوماتيكالي في سلالة ماوس بيترانسجينيك واحد. مع مستضد SV40 تي قمع مهام القمعية الورم Rb و p53، وضع الفئران أورام الغدد الصم العصبية البنكرياس بطريقة مماثلة ل tumorigenesis البشرية، مع المراحل بما في ذلك تضخم والأوعية، والورم الحميد، وسرطان الغازية. هذا النموذج التمزق-العلامة كانت مفيدة جداً لفهم السمات المميزة للسرطان، لا تقتصر على أورام الغدد الصم العصبية البنكرياس. فقد استخدمت أيضا في التجارب الإكلينيكية 8.
نقدم بروتوكول لنقل الجينات الجسدية من خلال ضخ إينتراكاردياكالي الفيروسات القهقرية إنفلونزا الطيور في التمزق–الوسم؛ مزق–tva الفئران. يتطلب نجاح العدوى بالفيروسات القهقرية إنفلونزا الطيور المستمدة من ركاسبب بنشاط تكاثر الخلايا المستهدفة. لذلك، اخترنا التمزق–الوسم؛ مزق–tva الفئران في 7 أسابيع عمر، عندما يتطور فرط تنسج في حوالي 50% جزيرات البنكرياس. حقن intracardiac البطين الأيسر من الفيروسات عيار عالية مطلوب لتحقيق كفاءة عدوى من 10-20% 4. طريقة التسليم هذه يقلل التخفيف الكبير من الجزيئات الفيروسية داخل الدورة الدموية من قبل الفيروسات تصل إلى جزيرات البنكرياس.
باستخدام هذا النهج، أثبتنا سابقا أن يعزز Bcl-xL سرطان خبيث مستقلة بوظيفة مكافحة–أبوبتوتيك 4،9. هذه الدالة المنتشر المضادة-أبوبتوتيك-مستقلة لم يلاحظ عندما أعرب Bcl-xL عبر التحوير في كافة الخلايا β البنكرياس في جميع أنحاء أونتوجيني الورمية في التمزق–الوسم؛ RIP-Bcl-xL الفأر نموذج 10. ولذلك، يوفر الطراز الماوس لدينا فرصة فريدة لتحديد وتوصيف الوظائف الجينات المعبر عنه في مرحلة لاحقة من توموريجينيسيس. لأن 2-4% جزيرات تتطور إلى أورام في التمزق–الوسم؛ مزق–tva بيترانسجينيك الفئران دون العدوى الفيروسية، وليس كل الآفات premalignant مصابون بالفيروسات القهقرية إنفلونزا الطيور المستمدة من ركاسبب، ويمكن التعرف على العوامل التي تمنح ميزة انتقائية على المسار الطبيعي توموريجينيسيس فقط. على وجه الخصوص، المنتشر العوامل الأكثر سهولة سيعترف بهذا الأسلوب، نظراً لورم خبيث بالغدد الليمفاوية البنكرياس أو الأجهزة الأخرى لا يحدث عادة في التمزق–الوسم؛ مزق–tva الفئران.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة، وصفت لنا نموذج ماوس قوية، التمزق–الوسم؛ مزق–tva، لتحقيق إيصال الجينات الجسدية عن طريق الفيروسات القهقرية إنفلونزا الطيور لتحديد وتوصيف العوامل المنتشر. على الرغم من أن التمزق–الوسم؛ مزق–tva الفئران تطوير أورام الغدد الصم العصبية البنكرياس، المنتشر العوامل المحد…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر هارولد فارموس، براين جيم لويس، Hanahan دوغلاس، هوانغ داني، بانغ شارون، ميغان وونغ، وماناسي م. جودبولي. Y.C.N.D. معتمد من قبل وزارة الدفاع منحة W81XWH-16-1-0619 والمعاهد الوطنية للصحة منحة 1R01CA204916.
Materials
| RCASBP-Y DV plasmid | Addgene | 11478 | |
| RCAS-RNAi plasmid | Addgene | 15182 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | 25-005-CI | |
| L-glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| Penicillin-Streptomycin solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| PBS-/-, 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Superfect | Qiagen | 301305 | |
| Polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 326823 | |
| 0.45 mm Nalgene Syringe Filters with PES Membrane |
Thermo Scientific | 194-2545 | |
| Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| synaptophysin | Vector Laboratories | VP-S284 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-6101 | |
| AmpliTaq DNA Polymerase with Buffer II | Life Technologies | N8080153 | |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21106 |
References
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The multistep nature of cancer. Trends Genet. 9 (4), 138-141 (1993).
- Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. Genetically engineered mouse models in cancer research. Adv Cancer Res. 106, 113-164 (2010).
- Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
- Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS biology. 5 (10), e276 (2007).
- Hanahan, D. Heritable formation of pancreatic beta-cell tumours in transgenic mice expressing recombinant insulin/simian virus 40 oncogenes. Nature. 315 (6015), 115-122 (1985).
- Fisher, G. H., et al. Development of a flexible and specific gene delivery system for production of murine tumor models. Oncogene. 18 (38), 5253-5260 (1999).
- Orsulic, S. An RCAS-TVA-based approach to designer mouse models. Mamm Genome. 13 (10), 543-547 (2002).
- Tuveson, D., Hanahan, D. Translational medicine: Cancer lessons from mice to humans. Nature. 471 (7338), 316-317 (2011).
- Choi, S., et al. Bcl-xL promotes metastasis independent of its anti-apoptotic activity. Nat Commun. 7, 10384 (2016).
- Naik, P., Karrim, J., Hanahan, D. The rise and fall of apoptosis during multistage tumorigenesis: down-modulation contributes to tumor progression from angiogenic progenitors. Genes Dev. 10 (17), 2105-2116 (1996).
- Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors. J Virol. 61 (10), 3004-3012 (1987).
- Petropoulos, C. J., Payne, W., Salter, D. W., Hughes, S. H. Appropriate in vivo expression of a muscle-specific promoter by using avian retroviral vectors for gene transfer [corrected]. J Virol. 66 (6), 3391-3397 (1992).
- Dunn, K. J., Williams, B. O., Li, Y., Pavan, W. J. Neural crest-directed gene transfer demonstrates Wnt1 role in melanocyte expansion and differentiation during mouse development. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (18), 10050-10055 (2000).
- Loftus, S. K., Larson, D. M., Watkins-Chow, D., Church, D. M., Pavan, W. J. Generation of RCAS vectors useful for functional genomic analyses. DNA Res. 8 (5), 221-226 (2001).
- Bromberg-White, J. L., et al. Delivery of short hairpin RNA sequences by using a replication-competent avian retroviral vector. J Virol. 78 (9), 4914-4916 (2004).
- Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Dev Biol. 6 (2), (2006).
- Huse, J. T., et al. The PTEN-regulating microRNA miR-26a is amplified in high-grade glioma and facilitates gliomagenesis in vivo. Genes Dev. 23 (11), 1327-1337 (2009).
- Ahronian, L. G., Lewis, B. C. Generation of high-titer RCAS virus from DF1 chicken fibroblasts. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (11), 1161-1166 (2014).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS Biol. 5 (10), 2255-2269 (2007).
- Du, Y. C., Chou, C. K., Klimstra, D. S., Varmus, H. Receptor for hyaluronan-mediated motility isoform B promotes liver metastasis in a mouse model of multistep tumorigenesis and a tail vein assay for metastasis. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (40), 16753-16758 (2011).
- Guernet, A., Grumolato, L. CRISPR/Cas9 editing of the genome for cancer modeling. Methods. , (2017).
