Kimlik ve metastatik faktörler gen transferi ile karakterizasyonu roman RIP-etiketinin içine; RIP-tva fare modeli
Summary
Biz bir roman somatik gen aktarım sistem RIP-etiket kullanmak göstermek için bir iletişim kuralı mevcut; RIP-tva metastaz genlerinde fonksiyonu çalışmaya fare modeli. Kuş Retrovirüsler gen transferi önceden Malign, invaziv olmayan lezyonlar yetişkin farelerde pankreas β hücrelerinin içine sağlamak için intracardiacally teslim edilir.
Abstract
Metastatik kanser ölümleri solid tümör olan hastalarda yüzde 90’ını hesapları. Kanser metastaz sürücüleri daha iyi anlamak için ve yeni tedavi hedefleri belirlemek için acil bir ihtiyaç vardır. İlerleme birincil kanser metastaz için sürücü moleküler olayları araştırmak için bir bitransgenic fare modeli, RIP-Tag geliştirdik; RIP-tva. Bu fare modelinde, sıçan insülin organizatörü (RIP) pankreas beta hücrelerinde SV40 T antijen (etiket) ve reseptör alt grubu bir kuş lökozu virüs (tva) için ifade kullanıyor. Fareler pankreas nöroendokrin tümörlerin % 100 alellerle Hiperplazi, anjiogenez, adenoma ve invaziv karsinom gibi aşamaları ile insan tumorigenesis için benzer iyi tanımlanmış aşamalarla ile geliştirmek. Çünkü RIP-etiket; RIP-tva fareler metastatik hastalık geliştirmek değil, metastaz teşvik genetik değişikliklere kolayca belirlenebilir. Somatik gen aktarım tva ifade, pankreas β Proliferasyona premalign lezyonlar elde edilir kuş Retrovirüsler istenen genetik değişikliği barındıran İntrakardiyak sızdırma yoluyla. Bir titresi > ml başına 1 x 108 bulaşıcı birim vivo içinde enfeksiyon için uygun kabul edilir. Buna ek olarak, kuş Retrovirüsler tümörler RIP-etiket içinde türetilmiş hücre hatları bulaşabilir; RIP-tva fareler yüksek verimlilik ile. Hücre hatları metastatik faktörler karakterize etmek için de kullanılabilir. Burada nasıl bu fare modeli kullanmak ve tümör metastazı aday genler işlevleri değerlendirmek için satırları hücre göstermektedir.
Introduction
En kanserleri somatik mutasyon 1ile ortaya çıkmaktadır. Geleneksel genetiği fare modelleri (et) tumorigenesis 2için belirli genetik değişiklik katkısını önemli anlayışlar hazırladık. Ancak, bazı sınırlamaları vardır. Bu modellerin en büyük dezavantajı sadece bir doku bazı hücrelerde genetik değişiklikler elde insanlarda tümör oluşumu sporadik doğası çoğaltılmaz var. Transgenik ve nakavt fareler mutasyonların da germline geliştirme etkiler için potansiyeli vardır. Ayrıca, bu fare modelleri üreten pahalı ve zaman alıcı olduğunu.
Metastaz kanser alanında önemli bir konudur. Metastaz modelleme et içinde zor olmuştur. Spontan metastaz fare nadirdir. Alellerle değişken ve gecikme süresi uzun metastaz 3et içinde. Metastatik cascade erken adımda ortadan kalkar böylece deneysel metastaz modelleri fareler, dolaşımı içine direkt enjeksiyon hücre istihdam.
Bazı fare modelleri metastatik faktörler eğitim yukarıdaki sınırlamaları aşmak için bir bitransgenic fare modeli, RIP-Tag geliştirdik; RIP-tva4. Strateji alt grubu-A kuş lökozu virüs, tva 6,7için bir son derece senkronize tümör ilerleme fare modeli, RIP-etiket 5ve reseptör kullanımını birleştirerek üzerinde temel alır. Bu RIP-etiket; RIP-tvafare modeli gen somatically bir tek bitransgenic fare yük sunulmasına olanak sağlar. Rb ve p53 Tümör baskılayıcı fonksiyonlarını baskılayarak SV40 T antijen ile fareler Hiperplazi, anjiogenez, adenoma ve invaziv karsinom gibi aşamaları ile pankreas nöroendokrin tümör insan tumorigenesis benzer bir şekilde geliştirin. Bu RIP-Tag model kanser, bunlarla sınırlı olmamak için pankreas nöroendokrin tümör işaretlerinden anlayışımız için çok öğretici oldu. Preklinik denemeler 8‘ de kullanılmaktadır.
Biz kuş Retrovirüsler intracardiacally enjeksiyonuyla RIP-etiket içine somatik gen transferi için bir iletişim kuralı mevcut; RIP-tva fareler. Kuş Retrovirüsler RCASBP elde edilen başarılı enfeksiyonu aktif Proliferasyona hedef hücrelerin gerekli. Bu nedenle, RIP-Tag seçti; RIP-tva fareler, 7 hafta-in yaş, ne zaman Hiperplazi pankreas adacıkları yaklaşık % 50 geliştirir. Sol ventrikül İntrakardiyak enjeksiyon yüksek titresi virüslerin % 10-20 4bir enfeksiyon verimlilik elde etmek için gereklidir. Virüs pankreas adacıkları ulaşmadan bu teslim yöntemi dolaşım içinde viral parçacıkların önemli seyreltme azaltır.
Bu yaklaşımı kullanarak, daha önce Bcl-xL kanser metastaz onun anti-apoptotik işlev 4,9/ bağımsız teşvik göstermiştir. BCL-xL RIP-etiket tumorigenic Ontojeni boyunca tüm pankreas β hücrelerindeki bir transgene ile ifade edildi zaman bu anti-apoptotik-bağımsız metastatik işlev gözlenen değil; RIP-Bcl-xL fare modeli 10. Bu nedenle, bizim fare modeli tanımlamak ve tumorigenesis daha sonraki bir aşamada ifade genler işlevleri tanımlamak için eşsiz bir fırsat sunmaktadır. Çünkü adacıkları % 2-4’ü geliştirmek tümörler RIP-Tag; içinde içine RIP-tva bitransgenic fareler viral enfeksiyon ve tüm premalign lezyonlar olmadan RCASBP elde edilen kuş Retrovirüsler ile enfekte, sadece tumorigenesis doğal seyri üzerinde seçici bir avantaj görüşmek faktörler belirlenebilir. Özellikle, pankreas lenf düğümleri veya diğer organlara metastaz normalde RIP-Tag oluşmaz çünkü metastatik faktörler en kolay bu yöntem tarafından tanınır; RIP-tva fareler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, bir güçlü fare modeli, RIP-Tag açıkladığımız; RIP-tva, yoluyla kimlik ve metastatik faktörler karakterizasyonu için kuş Retrovirüsler somatik gen teslim elde etmek için. Her ne kadar RIP-etiket; RIP-tva fareler geliştirmek pankreas nöroendokrin tümör, bu fare modelde tanımlanan metastatik faktörler de metastaz diğer kanser türleri teşvik.
Bizim yaklaşım somatik genetik değişiklikler özellikle premalign lezyonlar pankreas β hücrel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Harold Varmus, Brian C. Lewis, Douglas Hanahan, Danny Huang, Sharon Pang, Megan Wong ve Manasi M. Godbole teşekkür ederim. Y.C.N.D. DOD grant W81XWH-16-1-0619 ve NIH grant 1R01CA204916 tarafından desteklenir.
Materials
| RCASBP-Y DV plasmid | Addgene | 11478 | |
| RCAS-RNAi plasmid | Addgene | 15182 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | 25-005-CI | |
| L-glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| Penicillin-Streptomycin solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| PBS-/-, 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Superfect | Qiagen | 301305 | |
| Polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 326823 | |
| 0.45 mm Nalgene Syringe Filters with PES Membrane |
Thermo Scientific | 194-2545 | |
| Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| synaptophysin | Vector Laboratories | VP-S284 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-6101 | |
| AmpliTaq DNA Polymerase with Buffer II | Life Technologies | N8080153 | |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21106 |
References
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The multistep nature of cancer. Trends Genet. 9 (4), 138-141 (1993).
- Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. Genetically engineered mouse models in cancer research. Adv Cancer Res. 106, 113-164 (2010).
- Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
- Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS biology. 5 (10), e276 (2007).
- Hanahan, D. Heritable formation of pancreatic beta-cell tumours in transgenic mice expressing recombinant insulin/simian virus 40 oncogenes. Nature. 315 (6015), 115-122 (1985).
- Fisher, G. H., et al. Development of a flexible and specific gene delivery system for production of murine tumor models. Oncogene. 18 (38), 5253-5260 (1999).
- Orsulic, S. An RCAS-TVA-based approach to designer mouse models. Mamm Genome. 13 (10), 543-547 (2002).
- Tuveson, D., Hanahan, D. Translational medicine: Cancer lessons from mice to humans. Nature. 471 (7338), 316-317 (2011).
- Choi, S., et al. Bcl-xL promotes metastasis independent of its anti-apoptotic activity. Nat Commun. 7, 10384 (2016).
- Naik, P., Karrim, J., Hanahan, D. The rise and fall of apoptosis during multistage tumorigenesis: down-modulation contributes to tumor progression from angiogenic progenitors. Genes Dev. 10 (17), 2105-2116 (1996).
- Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors. J Virol. 61 (10), 3004-3012 (1987).
- Petropoulos, C. J., Payne, W., Salter, D. W., Hughes, S. H. Appropriate in vivo expression of a muscle-specific promoter by using avian retroviral vectors for gene transfer [corrected]. J Virol. 66 (6), 3391-3397 (1992).
- Dunn, K. J., Williams, B. O., Li, Y., Pavan, W. J. Neural crest-directed gene transfer demonstrates Wnt1 role in melanocyte expansion and differentiation during mouse development. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (18), 10050-10055 (2000).
- Loftus, S. K., Larson, D. M., Watkins-Chow, D., Church, D. M., Pavan, W. J. Generation of RCAS vectors useful for functional genomic analyses. DNA Res. 8 (5), 221-226 (2001).
- Bromberg-White, J. L., et al. Delivery of short hairpin RNA sequences by using a replication-competent avian retroviral vector. J Virol. 78 (9), 4914-4916 (2004).
- Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Dev Biol. 6 (2), (2006).
- Huse, J. T., et al. The PTEN-regulating microRNA miR-26a is amplified in high-grade glioma and facilitates gliomagenesis in vivo. Genes Dev. 23 (11), 1327-1337 (2009).
- Ahronian, L. G., Lewis, B. C. Generation of high-titer RCAS virus from DF1 chicken fibroblasts. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (11), 1161-1166 (2014).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS Biol. 5 (10), 2255-2269 (2007).
- Du, Y. C., Chou, C. K., Klimstra, D. S., Varmus, H. Receptor for hyaluronan-mediated motility isoform B promotes liver metastasis in a mouse model of multistep tumorigenesis and a tail vein assay for metastasis. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (40), 16753-16758 (2011).
- Guernet, A., Grumolato, L. CRISPR/Cas9 editing of the genome for cancer modeling. Methods. , (2017).
