Øya analysen er en relativt ny, kostnadseffektiv analysen som kan brukes til å evaluere den grunnleggende locomotor virkemåten til Drosophila melanogaster. Dette manuskriptet beskriver algoritmer for automatisk databehandling og objektiv måling av øya analysen data, gjør denne analysen en følsom, høy gjennomstrømming avlesning for genetisk eller farmakologiske storskjermer.
Fremskritt innen neste generasjons sekvensering teknologi bidrar til identifisering av (kandidat) sykdom gener for bevegelsesforstyrrelser og andre nevrologiske sykdommer med en økende hastighet. Men er lite kjent om molekylære mekanismer som ligger til grunn for disse lidelser. Genetisk, molekylær og atferdsmessige verktøykassen i Drosophila melanogaster gjør denne modellen organismen spesielt nyttig å karakterisere ny sykdom gener og mekanismer på en høy gjennomstrømming måte. Likevel krever høy gjennomstrømming skjermene effektiv og pålitelig analyser at ideelt sett er kostnadseffektive og tillate den automatiske kvantifiseringen av egenskaper gjelder for disse lidelser. Øya analysen er en kostnadseffektiv og enkelt oppsett metoden for å evaluere Drosophila locomotor atferd. I denne analysen, blir fluer kastet på en plattform fra en fast høyde. Dette medfører en medfødt motor svar som gjør fluene å flykte fra plattformen i sekunder. I dag utføres kvantitative analyser av filmet øya analyser manuelt, som er en arbeidskrevende oppgave, spesielt når store skjermer.
Dette manuskriptet beskriver“Drosophila øya analysen” og “Øya analysen analyse” algoritmer for høy gjennomstrømming, automatisert databehandling og kvantifisering av øya analysen data. I oppsett samler en enkel webcam koblet til laptop en bilde serie plattformen mens analysen utføres. “Drosophila øya analysen” algoritme utviklet for åpen kildekode programvare Fiji behandler disse bildet serien og kvantifiserer, for hver eksperimentelle tilstand, antall fluer på plattformen over tid. “Øya analysen analyse” skriptet, kompatibel med gratisprogrammet R, utviklet automatisk behandle innhentet data og beregne om behandlinger/genotyper er statistisk forskjellige. Dette sterkt forbedrer effektiviteten til øya analysen og gjør det en kraftig avlesning for grunnleggende bevegelse og fly atferd. Det kan derfor brukes til store skjermer undersøker fly locomotor evne, Drosophila modeller av bevegelsesforstyrrelser, og narkotika effekt.
De siste årene, har fremskritt innen neste generasjons sekvensering teknologi sterkt bidratt til identifisering av gener underliggende degenerative bevegelsesforstyrrelser av hjernen (f.eks lillehjernen ataksi og Parkinsons), for perifere neuronal opprinnelse (f.eks amyotrofisk lateral sklerose og arvelige spastisk paraplegia), og muskel opprinnelse (f.eks Duchenne muskeldystrofi og myotonic dystrophy)1,2,3,4 . Til tross for dette, er lite kjent om molekylære mekanismer som ligger til grunn for de fleste av disse lidelsene. En bedre forståelse av disse mekanismene er avgjørende for å utvikle terapier.
Som mennesker kontrollert bevegelse i modellen organismer, som fly og bevegelse i Drosophila, av den sentrale hjernen, perifere nervesystemet og muskler. I tillegg den rask generasjonstid og genetisk verktøykassen i Drosophila gjør denne modellen organismen spesielt egnet for høy gjennomstrømming screening av gener involvert i bevegelsesforstyrrelser og for narkotikatesting5,6 . På grunn av betydelig antall betingelser som må testes i slike skjermer, pålitelig, kostnadseffektiv, og relativt enkle analyser, samt verktøy for å kvantifisere output resultatene på en automatisert måte, er svært ettertraktet.
Schmidt et al. (2012) 7 beskrev en rimelig test kalt “øya analysen” evaluere Drosophila locomotor atferd. Øya analysen har blitt brukt med hell i store screenings for å identifisere gener glia-spesifikke funksjoner7i evalueringen av Drosophila modeller av intellektuelle handikap8, og for generell vurdering av fly motor atferd9. Prinsippet utformingen av øya analysen består av en opphøyet plattform som flere fluer blir kastet. Dette medfører en medfødt motor virkemåten som gir sunn fluer å flykte fra plattformen i sekunder. Analysen måler antallet flyr igjen på plattformen over tid7,8,9. Alle disse funksjonene indikerer at øya analysen kan være et kraftig screeningsverktøy for tilblivelse involvert inne bevegelsesforstyrrelser.
Foreløpig er kvantitativ analyse filmet øya analysen data gjort manuelt7,8,9. For å forbedre effektiviteten av analysen, ble en rimelig metode utviklet for å kvantifisere halvautomatisk rømning av fluer fra plattformen. Oppsettet bruker en enkel webcam koblet til laptop for å samle bilde tid serie plattformen, med rammer kjøpt hver 0,1 s. rammer behandles deretter med makroen“Drosophila øya analysen” som kvantifiserer antall fluer på plattformen over tid. Makroen“Drosophila øya analysen” er delt inn i tre uavhengige sub makroer: (I) “Opprett stabel og projeksjon,” sub makro identifiserer ulike øya eksperimenter lagret i forskjellige undermapper og skaper en stabel og en projeksjon av hver tidsserier. (II) “Definere plattform” sub makroen åpnes fortløpende alle “Projection_image_name.tif” filer i enkelte eksperimentelle undermappene, da brukeren blir bedt om å definere manuelt øya plattformen som region av interesse (ROI). (III) “analyse” kvantifiserer automatisk antall flyr igjen på plattformen under tiden serien. Sub makroene kan kjøres etter hverandre (i en løpe) eller uavhengig. For statistiske dataanalyse utviklet et skript til å behandle automatisk innhentet data og bruke en statistisk test for å fastslå om behandlinger/genotyper oppfører seg vesentlig forskjellig fra hverandre (figur 1). Til slutt er det vist at dette oppsettet kan brukes til å evaluere og kvantifisere avvikende locomotor evne til Drosophila modell for ataksi-telangiectasia (AT).
Denne protokollen beskriver“Drosophila øya analysen” makroen som kvantitativt vurderer Drosophila motor oppførsel under øya analysen. Makroen teller nøyaktig fluene på plattformen over tid, gjør øya analysen svært sensitive og egnet for kvantitative høy gjennomstrømming evaluering av locomotor defekter. Metodikken kan sammenligne betingelsene, med fluer dyrket under ulike genetiske og/eller miljømessige forhold, herunder narkotika eksponering. Denne avlesning er derfor spesielt nyttig som oppdagelsesverktøy når utføre genetiske eller farmasøytiske storskjermer, når studere Drosophila modeller av bevegelsesforstyrrelser og andre nevrologiske sykdommer, eller undersøke bevegelse eller fly oppførsel.
Øya analysen protokollen presentert i dette manuskriptet gir fordelene over eksisterende/alternativ metoder. For eksempel er video-sporing bevegelse mye mer tidkrevende og mindre egnet for testing store utvalgene. Øya analysen er en høy gjennomstrømming screening verktøyet, og i denne forstand, er sammenlignbar med rask interaktive negative geotaxis (RING) analysen16. Forskjellen mellom to er at øya analyser tillater påvisning av et bredere spekter av locomotor problemer; russernes fluer forlate plattformen kan skyldes feil i flyet, hopping, eller gå atferd forårsaket av vingen (muskel/neuronal) og/eller ben (muskel/neuronal) feil. På den annen side, vurderer RING analysen defekter i klatring/gåing atferd skyldes etappe (muskel/neuronal) feil. Dersom brukerne er interessert i flere atferdsmessige readouts, kan øya analysen også kombineres med andre analyser, for eksempel RING analysen. I tillegg lasere kreves for optogenetics kan enkelt installeres i boksen øya analysen, og oppsettet er så enkel at den kan lett flyttes til et rom der temperaturen og lys kan kontrolleres.
For å sikre suksess og reproduserbarhet til øya analysen beskrevet her, bør flere anbefalinger følges. Aliquot og overføre fluene eksperimentell test ampuller på minst en dag før å unngå virkningene av CO2 eller kald anestesi. Ikke overfylle eksperimentelle hetteglass (bruker 10-15 fluer per medisinglass, er det best å alltid plassere samme antall fluer per medisinglass). Holde fluene på fersk mat til alle tider. Hvis ikke ennå kjent med gjennomføre analysen, praksis kaster flyr på plattformen å maksimere avkastningen. Også praksis raskt trekke hånden rett etterpå som det forstyrrer dataanalyse (bildeanalyse og fly teller start før hånden er ut av bildet). Holde de miljømessige og eksperimentelle forholdene identiske eksperimenter som skal sammenlignes (f.eks kontroller versus mutanter eller et genotype testet på ulike aldersgrupper). Alltid utføre eksperimenter på samme tid av dagen og opprettholde hetteglass under kontrollert temperatur og luftfuktighet. Statistisk makt, teste minst tre tekniske gjentak per biologiske replikere.
For å sikre vellykket ytelsen til makroen som beskrives her, webkamera og innstillinger må justeres for å oppnå maksimal kontrast: flyr vises som svarte objekter på en hvit plattform. Når antall fluer ikke regnes riktig makroen, justere kontrasten, se om Avkastningen er riktig valgt og sikre at flyr på plattformen er over angitte minimumsverdien fly innstillingen (se trinn 8.3 av denne protokollen). Innstillingene må bare defineres én gang. De gjelder for alle eksperimenter, som avstanden mellom webkameraet og plattformen ikke er endret. Circularity_min og maks innstillinger definerer circularity av partikler (partikler = telt fluer) som vil bli tatt i betraktning for analyse (flyr = telt objekter). 1 representerer en perfekt sirkel, og 0 representerer en linje17. Siden fluene presentere alltid en viss grad av circularity (et fly ikke kan vises som en rett linje), den “Circularity_max”-innstillingen er satt til 1 og innstillingen “Circularity_min” er satt på 0,4. Det er usannsynlig at du må justere disse innstillingene.
Makroen gjør noen ganger telling feil når en flue ligger nær grensen til plattformen. Dette kan skje hvis fluene ikke kan fly men spasertur av brukerdefinerte Avkastningen. Oftest kanne merke Avkastningen (montering det så mye som mulig til plattformen) lett oppklare problemet. Men skriptet “Øya analysen analyse” er kjøpedyktig merker og riktige feil data teller forårsaket av fluer gangavstand av Avkastningen relativt godt. Selv om oppløsningen til webkameraet presenteres her er høy nok til å diskriminere fluer i nærheten ganske godt, har vi implementert flere algoritmer i bildet behandlingen prosedyren for“Drosophila øya analysen” makroen, som den vannskille og eroderes funksjonen17. Disse lette riktig avgrensning av fluer i nærheten på plattformen. i tillegg makroen er ikke kan skille mellom fluene som hoppet fra plattformen eller fløy fra den. Likevel, det er vanligvis observert at friske unge fly stammer fly bort umiddelbart når slippes på plattformen, mens eldre fluer og fluer med locomotor underskudd forbli lenger på plattformen og vil til slutt hoppe eller faller av plattformen. Til tross for disse begrensningene gir analysen og analyse en svært nøyaktig grad av locomotor atferd.
For å sikre vellykket resultatene av skriptet “Øya analysen analyse”, må brukeren sørge for å angi riktig banene for input og output filene i skript-rader som er angitt i protokollen og gi dataene i riktig mappe format (som angitt i figur 2). Hvis brukeren finner kriteriet for å filtrere ut upålitelige eksperimentelle data for strenge (rad 68: den første verdien i kolonnen “Teller” er mindre enn eller lik 5, rad 71: den første verdien i kolonnen “Teller” er høyere enn det totale antallet fluer kastet på platfo RM 3), slå av disse innstillingene ved å legge en # foran teksten i rader 68 og 71 i skriptet “Øya analysen analyse”. I dette tilfellet inkluderes alle datasett i analysen. Eventuelt kan innstillinger endres ved å justere verdiene i radene med 68 og 71 i henhold til brukernes behov. Mulig gjenstander i telle verdiene i “results.txt” genereres“Drosophila øya analysen” makroen kan også justeres manuelt, og skriptet kan kjøres igjen på justert dataene. Når brukeren er interessert i behandling av mer enn 10 fps, eller mer enn 10 s data, antall rammer behandles av skriptet “Øya analysen analyse” børjusteres. Den statistiske analysen kan også bli erstattet av brukerdefinerte alternativer.
En mappe kalt “Eksempler øya analysen,” som inneholder eksempler med bilde tidsserier får øya analysen, kan finnes på følgende nettsted: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. Last ned mappen “Eksempler øya analysen” og Følg fremgangsmåten beskrevet i denne protokollen for raskt bli kjent med strukturen for fillagring, behandling av bilder med makroen “Drosophila øya analysen” og “Øya analysen analyse” skriptet.
Øya analysen, kan i kombinasjon med utviklet makro og analyse skript, brukes til å evaluere og kvantifisere avvikende bevegelse virkemåten til en Drosophila modell av ataksi-Telangiectasia. Siden analysen kan effektivt brukes til ulike aldre, er det godt egnet til å analysere fenotyper potensielt progressiv natur.
Oppsummert er øya analysen, i kombinasjon med makroen“Drosophila øya analysen” og “Øya analysen analyse” manuset, en kostnadseffektiv, pålitelig og svært effektiv analysen objektivt analysere og kvantifisere locomotor feil av Drosophila modeller av bevegelsesforstyrrelser på en høy gjennomstrømming måte.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkjenner Vienna Drosophila Resource Center og Bloomington Drosophila lager center (NIH P40OD018537) for å gi Drosophila stammer. Vi er takknemlige for Klämbt laboratorium for å introdusere oss til øya analysen og Martijn Eidhof for å bygge øya analysen oppsettet. Denne studien var i delen støttet av E-SJELDNE-3 felles transnasjonale kaller gi “Forbereder terapi for autosomalt recessiv ataxias” FORBERED (NWO 9003037604), av en topp grant (912-12-109) fra Nederland organisasjonen for vitenskapelig forskning (NWO), og ved to DCN/Radboud University Medical Center PhD stipend. Fond ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet.
25 x 95 mm Drosophila vials | Flystuff | 32-116SB | – |
Logitech C525 HD Webcam | Logitech | – | Any webcam with USB connection is suitable. |
Stand to hold webcam | – | – | – |
Lamp | – | – | 12 V LED lights are appropriate |
Pounding pad | – | – | Any mouse pad works |
Island Assay box | – | – | Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20×30 cm. Transparent. |
Island Assay bath | – | – | Dimensions 42x38x25 cm. Non white. |
Island/platform | – | – | Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white. |
Soap | – | – | Standard dishwashing detergent is suitable. |
Computer | – | – | Scripts run both on Windows and Mac |
Image-recording software: HandiAvi® | AZcendant® | – | HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0) |
Image-recording software: WebcamCapture | – | – | Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting. |
Fiji | – | – | Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f |
R studio | – | – | Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
R | – | – | Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com |