جيل يعتمد على الاختيار ومستقل من كريسبر / كاس 9 بوساطة جين نوكوتس في خلايا الثدييات
Summary
التطورات الحديثة في القدرة على التلاعب وراثيا خطوط الخلايا الجسدية تنطوي على إمكانات كبيرة للبحوث الأساسية والتطبيقية. هنا، نقدم نهجين ل كريسبر / Cas9 ولدت إنتاج خروج المغلوب وفحص في خطوط الخلايا الثدييات، مع وبدون استخدام علامات للاختيار.
Abstract
وقد أحدث نظام هندسة الجينوم كريسبر / Cas9 ثورة في علم الأحياء من خلال السماح بالتحرير الدقيق للجينوم مع القليل من الجهد. يسترشد دليل واحد الحمض النووي الريبي (سغرنا) التي تمنح خصوصية، البروتين Cas9 ينسج كلا من خيوط الحمض النووي في المكان المستهدف. يمكن أن يؤدي دنا كسر إما غير متماثلة نهاية الانضمام (نهيج) أو التماثل الموجهة إصلاح (هر). يمكن أن نيج إدخال الحذف الصغيرة أو الإدراج التي تؤدي إلى الطفرات التحول الإطار، في حين أن تقرير التنمية البشرية يسمح للاضطرابات أكبر وأكثر دقة. هنا، نقدم بروتوكولات لتوليد خطوط الخلايا خروج المغلوب من خلال اقتران أسس أساليب كريسبر / Cas9 مع خيارين لاختيار / المصب المصب. نهج نهيج يستخدم واحد سغرنا قطع الموقع واختيار مستقل الفرز، حيث يتم تقييم إنتاج البروتين من قبل نقطة إمونوبلوت بطريقة عالية الإنتاجية. يستخدم نهج تقرير التنمية البشرية اثنين من المواقع سغرنا قطع التي تمتد الجين من الفائدة. جنبا إلى جنب مع قالب هر المتاحة، يمكن لهذه الطريقة تحقيق الحذفمن عشرات كيلو بايت، بمساعدة من علامة المقاومة للاختيار المدرجة. وتناقش التطبيقات والمزايا المناسبة لكل طريقة.
Introduction
وتوفر التعديلات الوراثية المستقرة ميزة على الطرق العابرة للاضطرابات الخلوية، التي يمكن أن تكون متغيرة في كفاءتها ومدتها. أصبح التحرير الجينومي شائعا على نحو متزايد في السنوات الأخيرة بسبب تطور نوكليسيس محددة الهدف، مثل نوكليسيس الزنك الاصبع 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، النسخ المنشط مثل نوكليسيس المستجيب (تالينس) 6 ، 7 ، 8 ، 9 و نوكليسيس الموجهة من الحمض النووي الريبي المستمدة من متفاوتة، متداخلة بانتظام يتكرر متناوب قصيرة (كريسبر) النظام 10 .
يتم تعديل آلات التحرير كريسبر / Cas9 من جهاز المناعة التي البكتيريا واستخدام الحفريات للدفاع ضد العدوى الفيروسيةأس = "كريف"> 11 ، 12 ، 13 . في هذه العملية، يتم دمج قصيرة، 20-30 نت أجزاء من تسلسل الفيروسية الغازية في مكان الجينومية كما "الفواصل" يحيط بها وحدات تكرار 14 ، 15 . النسخ اللاحق وتجهيز الحمض النووي الريبي يولد الرنا الصغيرة المرتبطة كريسبر 16 (كرناس) أنه، جنبا إلى جنب مع الحمض الريبي النووي النقال عبر تفعيل 17 (تراكرنا)، والتجمع مع المستجيب إندوسلياز كاس 9. وبالتالي فإن الحمض الريبي النووي النووي توفر خصوصية لاستهداف Cas9، وتوجيه المجمع لتسلسل تسلسل الحمض النووي الفيروسي التكميلي ومنع المزيد من الإصابات 18 ، 19 . أي تسلسل "بروتسباسر" في الحمض النووي المستهدف يمكن أن تكون بمثابة مصدر للحمض الريبي النووي الذواب، طالما أنها مباشرة 5 'إلى بروتسباسر قصيرة عزر المجاورة (بام)، نغ في حالة S. القيثريات Cas9 <sأوب كلاس = "كريف"> 20. عدم وجود تسلسل بام بالقرب من فاصل في المكان المضيف كريسبر يميز بين الذات وغير الذاتي، ومنع استهداف المضيف. بسبب عالميتها ومرونتها، وقد تم تكييف هذا النظام البيولوجي بقوة لتعديل الجينومية، بحيث أن ما يقرب من أي موقع الحمض النووي المجاورة بام يمكن استهدافها. في هذا الإصدار، تعديل تنصهر مزيد من الحمض الريبي النووي الذواب و تراكرنا إلى عنصر واحد رنا (سغرنا) المكون الذي يتم تحميله في البروتين Cas9 21 .
عند التعبير عن Cas9 و سغرنا في خلايا حقيقيات النواة، البروتين Cas9 ينسج كلا من خيوط الحمض النووي في الموضع المستهدف. في غياب منطقة مناسبة من تسلسل مثلي، الخلية بإصلاح هذا كسر عبر غير متماثلة نهاية الانضمام (نهيج) 22 ، 23 ، 24 ، والتي عادة ما يقدم الحذف الصغيرة أو، نادرا، والإدراج. عند استهداف فتحإطار القراءة، والإصلاح المرجح أن يؤدي إلى فرامشيفت متعدية التي تنتج منتج البروتين غير وظيفية. في المقابل، عندما قدمت مع قالب خارجي مع مناطق واسعة من التماثل، والخلية قد إصلاح كسر مزدوج حبلا عن طريق التماثل الموجه إصلاح 25 ، 26 . هذا الطريق يسمح لحذف دقيقة أكبر، واستبدال أو الإدراج في الجينوم، إلى جانب إدخال علامات اختيار قابلة للإعجاب 27 .
هنا، نقدم بروتوكولات لتوليد خطوط الخلايا خروج المغلوب من قبل أي من هذين الأسلوبين كريسبر / Cas9 ( الشكل 1A ). نهج نهيج يستخدم واحد سغرنا قطع الموقع واختيار الاختيار المستقل، وبالتالي يتطلب إعداد مقدما قليلا. عند استخدام هذا الأسلوب، دليل رنا مكملة ل إكسونس بالقرب من نهاية 5 'من النص، والتي من المرجح أن تنتج خروج المغلوب، يجب أن تصمم. منذ موديفيكاتالأيونات إلى الجينوم في هذه الحالة هي صغيرة، ويستند فحص لاستنساخ خروج المغلوب على البقع نقطة، حيث يتم تقييم المنتج البروتين بطريقة عالية الإنتاجية. نحن نستخدم الجيل من 1-بروتين (ELAVL1) خطوط خروج المغلوب إيلاف كمثال على ذلك. النهج الثاني يعتمد على التماثل الموجه إصلاح (هر) ويستخدم اثنين من سغرنا قطع المواقع التي تمتد الجين أو المنطقة من الفائدة، مما يسمح لحذف عشرات من كيلو بايت. A البلازميد مع منطقتين من التماثل التي تحيط مواقع الانقسام يوفر قالب بديل ( الشكل 1B )، وإدخال علامة المقاومة للاختيار الذي يزيد من كفاءة توليد خروج المغلوب. ويمكن أيضا أن تتكيف هذه الطريقة لإدخال تعديلات الجينات مع الأسلحة التماثل مصممة بشكل صحيح. في هذه الحالة، ودمج جزء جديد من الحمض النووي يسمح لفحص ير القائم ( الشكل 1C ). هنا، ونحن نستخدم جيل من أفراد الأسرة بميليو رنا ملزمة ملزمة 2 (PUM2) خطوط خروج المغلوب كمثال.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد سمح نظام كريسبر / Cas9 بتوليد كفاءة من التعديلات الجينومية المستقرة، التي توفر بديلا أكثر اتساقا لطرق التلاعب العابرة الأخرى. هنا، قدمنا طريقتين لتحديد السريع من كريسر / Cas9 خروج المغلوب الجينات في خطوط الخلايا الثدييات. كلا الأسلوبين تتطلب القليل من المواد الخل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يعترفوا جيسيل سانشيز، ميغان لي، وجيسون إستيب للمساعدة التجريبية، و ويفنغ قو و شيمي تشن لتبادل الكواشف.
Materials
| Competent E. coli cells | |||
| plasmid prep kit | |||
| pSpCas9(BB) plasmid | Addgene | 42230 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| BbsI enzyme | ThermoFisher | FD1014 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| Tango Buffer | ThermoFisher | BY5 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| Q5 hot start high fidelity polymerase | NEB | M0494A | HA amplification |
| pUC19-BsaI | Modified pUC19 plasmid, mutated existing BsaI site and inserted two outward facing BsaI sites after BamHI/EcoRI digestion | ||
| pGolden-Neo | Addgene | 51422 | Resistance cassette |
| pGolden-Hygro | Addgene | 51423 | Resistance cassette |
| BsaI enzyme | NEB | R3535S | Homology arm contruction |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | |
| Toothpicks | bacterial PCR | ||
| Taq polymerase | bacterial colony PCR | ||
| HEK293 human cells | |||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Corning | MT35010CV | |
| Penicillin-Strep (opt.) | Gibco | 15140-122 | |
| 6 well plates | BioLite | 12556004 | |
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2300 | for lipofection only |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | for lipofection only |
| G418 (Neomycin) | Sigma Aldrich | A1720-5G | |
| Hygromycin | Sigma Aldrich | H3274-250MG | |
| 96 well plates | ThermoFisher | 12556008 | |
| Passive Lysis Buffer, 5x | Promega | ||
| 1xSDS loading buffer | recipe decribed in protocol | ||
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| TBST | recipe decribed in protocol | ||
| Dehydrated milk | |||
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | for HRP-conjugated secondary antibodies |
| Extracta DNA prep for PCR | Quantabio | 95091-025 | |
| KOD polymerase | Novagen | 71316 |
References
- Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).
- Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1156-1160 (1996).
- Bibikova, M., et al. Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases. Mol Cell Biol. 21 (1), 289-297 (2001).
- Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
- Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks. Mol Cell Biol. 23 (10), 3558-3565 (2003).
- Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
- Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
- Christian, M., et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics. 186 (2), 757-761 (2010).
- Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems. Annu Rev Microbiol. 69, 209-228 (2015).
- Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
- Karginov, F. V., Hannon, G. J. The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea. Mol Cell. 37 (1), 7-19 (2010).
- Wiedenheft, B., Sternberg, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
- Mojica, F. J., Diez-Villasenor, C., Garcia-Martinez, J., Soria, E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol. 60 (2), 174-182 (2005).
- Pourcel, C., Salvignol, G., Vergnaud, G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology. 151 (Pt 3), 653-663 (2005).
- Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321 (5891), 960-964 (2008).
- Deltcheva, E., et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 471 (7340), 602-607 (2011).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322 (5909), 1843-1845 (2008).
- Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
- Guirouilh-Barbat, J., et al. Impact of the KU80 pathway on NHEJ-induced genome rearrangements in mammalian cells. Mol Cell. 14 (5), 611-623 (2004).
- Moore, J. K., Haber, J. E. Cell cycle and genetic requirements of two pathways of nonhomologous end-joining repair of double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 16 (5), 2164-2173 (1996).
- Liang, F., Han, M., Romanienko, P. J., Jasin, M. Homology-directed repair is a major double-strand break repair pathway in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5172-5177 (1998).
- Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Luo, Y., Lin, L., Bolund, L., Sorensen, C. B. Efficient construction of rAAV-based gene targeting vectors by Golden Gate cloning. Biotechniques. 56 (5), 263-268 (2014).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).
