Selezione-dipendente e generazione indipendente di CRISPR / Cas9-mediata Gene Knockouts nelle cellule di mammiferi
Summary
I recenti progressi nella capacità di manipolare geneticamente le linee cellulari somatiche hanno un grande potenziale per la ricerca di base e applicata. Qui presentiamo due approcci per la produzione e lo screening generati da CRISPR / Cas9 nelle linee cellulari mammiferi, con e senza l'uso di marcatori selectable.
Abstract
Il sistema di ingegneria del genoma CRISPR / Cas9 ha rivoluzionato la biologia permettendo di modificare il genoma in modo preciso e con poco sforzo. Guidato da una singola guida RNA (sgRNA) che conferisce specificità, la proteina Cas9 ferma entrambi i fili di DNA nel luogo di destinazione. La rottura del DNA può scatenare un collegamento non terminale (NHEJ) o una riparazione diretta (HDR) omologica. NHEJ può introdurre piccole delezioni o inserzioni che portano a mutazioni di fotogrammi, mentre HDR consente perturbazioni più grandi e più precise. Qui presentiamo i protocolli per la generazione di linee di cellule di knockout accoppiando i metodi CRISPR / Cas9 stabiliti con due opzioni per la selezione / screening a valle. L'approccio NHEJ utilizza un singolo sito di taglio sgRNA e uno screening indipendente dalla selezione, in cui la produzione di proteine viene valutata mediante immunoblot dot in modo ad alto rendimento. L'approccio HDR utilizza due siti di taglio sgRNA che spaziano sul gene di interesse. Insieme a un modello HDR fornito, questo metodo può raggiungere la cancellazioneDi decine di kb, aiutato dal marker di resistenza selezionabile inserito. Vengono discusse le opportune applicazioni ei vantaggi di ciascun metodo.
Introduction
Le alterazioni genetiche stabili offrono un vantaggio rispetto ai metodi transitori di perturbazione cellulare, che possono essere variabili nella loro efficienza e durata. L'editing genomico è diventato sempre più comune negli ultimi anni a causa dello sviluppo di nucleasi specifiche di target, quali le nucleasi di zinco-dito , 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , nucleasi efficace (TALEN) simili all'attivatore di trascrizione 6 , 7 , 8 , 9 E nucleasi guidate da RNA derivate dal sistema di ripetizioni palindromiche corte (CRISPR) regolarmente interspaziate in cluster 10 .
La macchina di montaggio CRISPR / Cas9 è adattata da un sistema immunitario che batteri e archea usano per difendersi dalle infezioni viraliAss = "xref"> 11 , 12 , 13 . In questo processo, brevi, 20-30 nt frammenti di sequenza virale invasiva sono incorporati in un locus genomico come "distanziatori" fiancheggiati da unità ripetitive 14 , 15 . La successiva trascrizione e l'elaborazione di RNA generano piccoli RNA 16 associati a CRISPR (crRNAs) che, insieme a un crRNA trans-attivante 17 (tracrRNA), si riuniscono con l'endonucleasi efficace Cas9. I crRNA forniscono quindi la specificità per il targeting di Cas9, guidando il complesso per sequestrare sequenze DNA complementari virali e prevenire ulteriori infezioni 18 , 19 . Ogni sequenza "protospacer" nel DNA mirato può servire come fonte del CRRNA, purché sia direttamente 5 'a un breve motivo adiacente protospacer (PAM), NGG nel caso di S. pyogenes Cas9 <sUp class = "xref"> 20. L'assenza della sequenza PAM vicino al distanziatore nel loco CRISPR dell'host distingue tra auto e non-auto, impedendo il targeting dell'host. A causa della sua universalità e flessibilità, questo sistema biologico è stato fortemente adattato per l'editing genomico, in modo che quasi tutti i siti adiacenti del PAM possano essere mirati. In questa versione, un'ulteriore modifica ha fuso la crRNA e la tracrRNA in un singolo componente RNA (sgRNA) guida che è caricato nella proteina Cas9 21 .
Dopo l'espressione di Cas9 e di un sgRNA nelle cellule eucariotiche, la proteina Cas9 elimina entrambi i fili di DNA nel luogo di destinazione. In assenza di una regione adatta di sequenza omologa, la cella risolve questa rottura mediante l'adesione finale non omologica (NHEJ) 22 , 23 , 24 , che presenta tipicamente piccole delezioni o, raramente, inserzioni. Quando si punta ad un apertoLa riparazione probabilmente porta ad un frameshift traslatorio che produce un prodotto proteico non funzionale. Al contrario, quando è dotato di un modello esogeno con grandi regioni di omologia, la cellula può fissare la rottura a doppio filamento con la riparazione diretta dell'omologia 25 , 26 . Questo percorso consente di eliminazioni, sostituzioni o inserzioni nel genoma più precise, accoppiato con l'introduzione di marcatori di selezione accisa 27 .
Qui presentiamo i protocolli per la generazione di linee di cellule di knockout mediante uno di questi due metodi CRISPR / Cas9 ( Figura 1A ). L'approccio NHEJ utilizza un unico sito taglio sgRNA e uno screening indipendente dalla selezione, e quindi richiede una piccola preparazione anticipata. Quando si utilizza questo metodo, devono essere progettati i RNA complementari agli esoni prossimi all'estremità 5 della trascrizione, che sono più probabili a produrre un eliminazione. Dal momento che il modificatoGli ioni al genoma in questo caso sono piccoli, lo screening per i cloni di knockout si basa su macchie dot, dove il prodotto proteico viene valutato in modo ad alto rendimento. Ad esempio, usiamo la generazione di linee di eliminazione di ELAV come proteine 1 (ELAVL1). Il secondo approccio si basa sulla riparazione diretta dell'omologia (HDR) e utilizza due siti di taglio sgRNA che spaziano il gene o regione di interesse, consentendo la cancellazione di decine di kb. Un plasmide con due regioni di omologia che fiancheggiano i siti di scissione fornisce un modello di sostituzione ( Figura 1B ), introducendo un marker di resistenza selezionabile che aumenta l'efficienza della generazione di eliminazione. Questo metodo può anche essere adattato per introdurre modifiche geniche con armi di omologia adeguatamente progettate. In questo caso, l'integrazione di un nuovo frammento di DNA consente di effettuare uno screening basato su PCR ( Figura 1C ). Ad esempio, usiamo la generazione di linee di eliminazione di Pumilio RNA 2 (PUM2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Il sistema CRISPR / Cas9 ha permesso un'efficace generazione di modifiche genomiche stabili, che forniscono un'alternativa più coerente ad altri metodi di manipolazione transitoria. Ecco, abbiamo presentato due metodi per la rapida identificazione dei colpi di origine CRISPR / Cas9 nelle linee cellulari di mammiferi. Entrambi i metodi richiedono un piccolo materiale cellulare, pertanto i test possono essere eseguiti nelle fasi iniziali della coltura clonale, risparmiando tempo e reagenti. Per aumentare l'ef…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero riconoscere Gissell Sanchez, Megan Lee e Jason Estep per l'assistenza sperimentale, e Weifeng Gu e Xuemei Chen per la condivisione di reagenti.
Materials
| Competent E. coli cells | |||
| plasmid prep kit | |||
| pSpCas9(BB) plasmid | Addgene | 42230 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| BbsI enzyme | ThermoFisher | FD1014 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| Tango Buffer | ThermoFisher | BY5 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| Q5 hot start high fidelity polymerase | NEB | M0494A | HA amplification |
| pUC19-BsaI | Modified pUC19 plasmid, mutated existing BsaI site and inserted two outward facing BsaI sites after BamHI/EcoRI digestion | ||
| pGolden-Neo | Addgene | 51422 | Resistance cassette |
| pGolden-Hygro | Addgene | 51423 | Resistance cassette |
| BsaI enzyme | NEB | R3535S | Homology arm contruction |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | |
| Toothpicks | bacterial PCR | ||
| Taq polymerase | bacterial colony PCR | ||
| HEK293 human cells | |||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Corning | MT35010CV | |
| Penicillin-Strep (opt.) | Gibco | 15140-122 | |
| 6 well plates | BioLite | 12556004 | |
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2300 | for lipofection only |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | for lipofection only |
| G418 (Neomycin) | Sigma Aldrich | A1720-5G | |
| Hygromycin | Sigma Aldrich | H3274-250MG | |
| 96 well plates | ThermoFisher | 12556008 | |
| Passive Lysis Buffer, 5x | Promega | ||
| 1xSDS loading buffer | recipe decribed in protocol | ||
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| TBST | recipe decribed in protocol | ||
| Dehydrated milk | |||
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | for HRP-conjugated secondary antibodies |
| Extracta DNA prep for PCR | Quantabio | 95091-025 | |
| KOD polymerase | Novagen | 71316 |
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