포유류 세포에서 CRISPR / Cas9 매개 유전자 knockouts의 선택 의존 및 독립적 생성
Summary
체세포를 유 전적으로 조작하는 능력의 최근 진보는 기본 및 응용 연구에 큰 가능성을 안겨줍니다. 여기, 우리는 선택 마커의 사용 여부에 관계없이 포유류 세포주에서 CRISP / Cas9 생성 녹아웃 생산 및 스크리닝을위한 두 가지 접근법을 제시한다.
Abstract
CRISPR / Cas9 게놈 공학 시스템은 적은 노력으로 정확한 게놈 편집을 가능하게함으로써 생물학에 혁명을 일으켰습니다. 특이성을 부여하는 단일 가이드 RNA (sgRNA)에 의해 유도 된 Cas9 단백질은 표적 유전자좌에서 DNA 가닥 둘 모두를 절단합니다. DNA가 끊어지면 NHEJ (homologous end joining) 또는 homology directed repair (HDR)가 유발 될 수 있습니다. NHEJ는 프레임 변이 돌연변이를 유도하는 작은 결실 또는 삽입을 도입 할 수있는 반면, HDR은 더 크고 더 정확한 섭동을 허용한다. 여기, 우리는 다운 스트림 선택 / 스크리닝을위한 두 가지 옵션으로 설립 CRISPR / Cas9 방법을 결합하여 녹아웃 세포 라인을 생성하기위한 프로토콜을 제시합니다. NHEJ 접근법은 하나의 sgRNA 절단 사이트와 선택에 의존하지 않는 스크리닝을 사용하며, 단백질 생산은 도트 면역 블롯 (dot immunoblot)으로 높은 처리량 방식으로 평가됩니다. HDR 접근법은 관심있는 유전자를 스팬하는 2 개의 sgRNA 절단 부위를 사용합니다. 제공된 HDR 템플릿과 함께이 메소드는 삭제를 수행 할 수 있습니다.삽입 된 선택 저항 마커의 도움을 받아 수십 kb의 적절한 방법과 각 방법의 장점에 대해 설명합니다.
Introduction
안정한 유전 적 변형은 일시적인 세포 섭동 (perturbation)의 방법보다 이점을 제공하는데, 이는 효율성과 지속 기간이 가변적 일 수 있습니다. 게놈 편집은 징크 핑거 핵산 분해 효소 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 전사 활성제 유사 이펙터 핵산 효소 (TALENs) 6 , 7 , 8 , 9 와 같은 표적 특이 적 뉴 클레아 제의 개발로 인해 최근에 점점 더 보편화되고있다. (CRISPR) 시스템 10 에서 유래 된 RNA 유도 뉴 클레아 제를 포함한다.
CRISPR / Cas9 편집 기계는 박테리아와 고세균이 바이러스 감염을 막기 위해 사용하는 면역계로부터 변형되었습니다.ass = "xref"> 11 , 12 , 13 . 이 과정에서, 침입 바이러스 서열의 짧은 20-30nt 단편이 반복 단위 14 , 15 에 의해 둘러싸인 "스페이서"로서 게놈 궤적에 편입된다. 후속 전사 및 RNA 프로세싱은 trans-activating crRNA 17 (tracrRNA)과 함께 작동 자 Cas9 엔도 뉴 클레아 제와 함께 조립되는 작은 CRISPR- 관련 RNAs 16 (crRNA)을 생성한다. 따라서 crRNA는 Cas9 표적화에 대한 특이성을 제공하고, 상보적인 바이러스 DNA 서열을 절단하고 추가 감염을 예방하기 위해 복합체를 유도한다 18 , 19 . 표적 DNA에있는 어떤 "protospacer"서열이라도 짧은 protospacer 인접 모티프 (PAM), S. pyogenes Casg의 경우 NGG에 직접 5 '있는 한, crRNA의 원천이 될 수있다 <sup class = "xref"> 20. 숙주의 CRISPR 궤적의 스페이서 근처에 PAM 서열이 없다는 것은 자기와 비 – 자기를 구별하여 숙주의 표적화를 방지한다. 이 생물학적 시스템은 보편성과 유연성으로 인해 거의 모든 PAM 인접 DNA 사이트를 타겟팅 할 수 있도록 게놈 편집에 강력하게 적응했습니다. 이 버전에서는 추가 변경으로 crRNA와 tracrRNA를 Cas9 단백질 21 에로드되는 단일 가이드 RNA (sgRNA) 성분으로 융합시켰다.
진핵 세포에서 Cas9와 sgRNA의 발현시, Cas9 단백질은 표적 유전자좌에서 두 DNA 가닥을 절단한다. 상 동성 서열의 적당한 영역이없는 경우, 세포는 전형적으로 작은 결실 또는 드물게 삽입을 유도하는 비 – 상 동성 말단 결합 (NHEJ) 22 , 23 , 24 를 통해 이러한 단절을 고정시킨다. 공개를 타겟팅 할 때판독 프레임에서, 수리는 비 기능성 단백질 생성물을 생성하는 번역적인 골격 이동을 유발할 수있다. 대조적으로, 큰 상 동성 영역을 갖는 외인성 템플레이트가 제공 될 때, 세포는 상 동성 지시에 의한 보수에 의해 이중 가닥 절단을 고칠 수있다 25 , 26 . 이 경로는 excisable 선택 마커 27 도입과 함께 게놈에서 더 큰 정확한 삭제, 교체 또는 삽입을 허용합니다.
여기, 우리는 두 가지 CRISPR / Cas9 방법 ( 그림 1A ) 중 하나에 의해 녹아웃 세포 라인을 생성하기위한 프로토콜을 제시합니다. NHEJ 접근법은 단일 sgRNA 절단 사이트 및 선발 독립 스크리닝을 사용하므로 초기 준비가 거의 필요하지 않습니다. 이 방법을 사용할 때 녹아웃을 생성 할 가능성이 가장 높은 전사 인자의 5 '말단 근처에있는 엑손과 상보적인 RNA를 고안해야합니다. 수정 이후이 경우 게놈에 대한 이온은 작으며, 녹아웃 클론을 스크리닝하는 것은 도트 블롯을 기반으로하며, 여기서 단백질 생산물은 고효율 방식으로 평가됩니다. 우리는 ELAV와 유사한 1 단백질 (ELAVL1) 녹아웃 라인을 예로 들어 사용합니다. 두 번째 접근법은 homology directed repair (HDR)에 의존하고 관심있는 유전자 또는 관심 영역에 걸친 2 개의 sgRNA 절단 부위를 사용하여 수십 kb의 결실을 허용합니다. 절단 부위의 측면에 위치하는 두 개의 상 동성 영역을 갖는 플라스미드는 녹아웃 생성의 효율을 증가시키는 선택 가능한 저항 마커를 도입하는 대체 주형 ( 도 1b )을 제공한다. 이 방법은 적절하게 설계된 상 동성 암으로 유전자 변형을 도입하는 데에도 적용될 수있다. 이 경우 새로운 DNA 단편을 통합하면 PCR 기반의 스크리닝이 가능합니다 ( 그림 1C ). 여기에서는 Pumilio RNA binding family member 2 (PUM2) knockout line의 생성을 예로 사용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR / Cas9 시스템은 다른 일시적인 조작 방법에 대한보다 일관된 대안을 제공하는 안정한 게놈 변형의 효율적인 생성을 가능하게했다. 여기, 우리는 포유 동물 세포 라인에서 CRISPR / Cas9 유전자 녹아웃의 신속한 식별을위한 두 가지 방법을 제시했습니다. 두 가지 방법 모두 세포질이 거의 필요하지 않으므로 클론 배양의 초기 단계에서 시험을 수행하여 시간과 시약을 절약 할 수 있습니다. 두 가?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 Gissell Sanchez, Megan Lee 및 Jason Estep을 실험 지원을 위해, Weifeng Gu와 Xuemei Chen은 시약 공유에 대해 인정하고 싶습니다.
Materials
| Competent E. coli cells | |||
| plasmid prep kit | |||
| pSpCas9(BB) plasmid | Addgene | 42230 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| BbsI enzyme | ThermoFisher | FD1014 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| Tango Buffer | ThermoFisher | BY5 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| Q5 hot start high fidelity polymerase | NEB | M0494A | HA amplification |
| pUC19-BsaI | Modified pUC19 plasmid, mutated existing BsaI site and inserted two outward facing BsaI sites after BamHI/EcoRI digestion | ||
| pGolden-Neo | Addgene | 51422 | Resistance cassette |
| pGolden-Hygro | Addgene | 51423 | Resistance cassette |
| BsaI enzyme | NEB | R3535S | Homology arm contruction |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | |
| Toothpicks | bacterial PCR | ||
| Taq polymerase | bacterial colony PCR | ||
| HEK293 human cells | |||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Corning | MT35010CV | |
| Penicillin-Strep (opt.) | Gibco | 15140-122 | |
| 6 well plates | BioLite | 12556004 | |
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2300 | for lipofection only |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | for lipofection only |
| G418 (Neomycin) | Sigma Aldrich | A1720-5G | |
| Hygromycin | Sigma Aldrich | H3274-250MG | |
| 96 well plates | ThermoFisher | 12556008 | |
| Passive Lysis Buffer, 5x | Promega | ||
| 1xSDS loading buffer | recipe decribed in protocol | ||
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| TBST | recipe decribed in protocol | ||
| Dehydrated milk | |||
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | for HRP-conjugated secondary antibodies |
| Extracta DNA prep for PCR | Quantabio | 95091-025 | |
| KOD polymerase | Novagen | 71316 |
References
- Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. 유전학. 188 (4), 773-782 (2011).
- Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1156-1160 (1996).
- Bibikova, M., et al. Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases. Mol Cell Biol. 21 (1), 289-297 (2001).
- Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. 유전학. 161 (3), 1169-1175 (2002).
- Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks. Mol Cell Biol. 23 (10), 3558-3565 (2003).
- Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
- Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
- Christian, M., et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. 유전학. 186 (2), 757-761 (2010).
- Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems. Annu Rev Microbiol. 69, 209-228 (2015).
- Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
- Karginov, F. V., Hannon, G. J. The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea. Mol Cell. 37 (1), 7-19 (2010).
- Wiedenheft, B., Sternberg, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
- Mojica, F. J., Diez-Villasenor, C., Garcia-Martinez, J., Soria, E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol. 60 (2), 174-182 (2005).
- Pourcel, C., Salvignol, G., Vergnaud, G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology. 151 (Pt 3), 653-663 (2005).
- Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321 (5891), 960-964 (2008).
- Deltcheva, E., et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 471 (7340), 602-607 (2011).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322 (5909), 1843-1845 (2008).
- Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
- Guirouilh-Barbat, J., et al. Impact of the KU80 pathway on NHEJ-induced genome rearrangements in mammalian cells. Mol Cell. 14 (5), 611-623 (2004).
- Moore, J. K., Haber, J. E. Cell cycle and genetic requirements of two pathways of nonhomologous end-joining repair of double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 16 (5), 2164-2173 (1996).
- Liang, F., Han, M., Romanienko, P. J., Jasin, M. Homology-directed repair is a major double-strand break repair pathway in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5172-5177 (1998).
- Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. 유전학. 196 (4), 961-971 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Luo, Y., Lin, L., Bolund, L., Sorensen, C. B. Efficient construction of rAAV-based gene targeting vectors by Golden Gate cloning. Biotechniques. 56 (5), 263-268 (2014).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).
