Geração independente dependente da seleção e de genes independentes de CRISPR / Cas9 em células de mamíferos
Summary
Os avanços recentes na capacidade de manipular geneticamente as linhas celulares somáticas possuem grande potencial para pesquisas básicas e aplicadas. Aqui, apresentamos duas abordagens para CRISPR / Cas9 gerado produção knockout e triagem em linhas de células de mamíferos, com e sem o uso de marcadores selecionáveis.
Abstract
O sistema de engenharia do genoma CRISPR / Cas9 revolucionou a biologia ao permitir uma edição precisa do genoma com pouco esforço. Guiado por um único guia de RNA (sgRNA) que confere especificidade, a proteína Cas9 cliva ambas as cadeias de DNA no locus alvo. A ruptura do DNA pode desencadear união final não homóloga (NHEJ) ou reparação direcionada a homologia (HDR). O NHEJ pode introduzir pequenas deleções ou inserções que levam a mutações de mudança de quadro, enquanto o HDR permite perturbações maiores e mais precisas. Aqui, apresentamos protocolos para geração de linhas celulares knockout através do acoplamento de métodos CRISPR / Cas9 estabelecidos com duas opções para seleção / rastreio a jusante. A abordagem NHEJ usa um único local de corte de sgRNA e rastreio independente de seleção, onde a produção de proteína é avaliada por imunotransferência ponto de uma maneira de alto rendimento. A abordagem HDR usa dois sites de corte de sgRNA que abrangem o gene de interesse. Juntamente com um modelo de HDR fornecido, esse método pode ser excluídoDe dezenas de kb, auxiliado pelo marcador de resistência selecionado inserido. São discutidas as aplicações e vantagens apropriadas de cada método.
Introduction
Alterações genéticas estáveis oferecem uma vantagem sobre os métodos transitórios de perturbação celular, que podem ser variáveis em sua eficiência e duração. A edição genômica tornou-se cada vez mais comum nos últimos anos devido ao desenvolvimento de nucleases específicas do alvo, como as nucleases de zinco-dedo 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , as nucleases efetoras do tipo ativador da transcrição (TALENs) 6 , 7 , 8 , 9 E nucleases guiadas por RNA derivadas do sistema de repetições palindrômicas curtas agrupadas, regularmente intercaladas (CRISPR) 10 .
A maquinaria de edição CRISPR / Cas9 é adaptada de um sistema imunológico que bactérias e archaea usam para se defender contra infecções viraisAss = "xref"> 11 , 12 , 13 . Neste processo, fragmentos curtos de 20-30 nt de sequência viral invasora são incorporados em um locus genômico como "espaçadores" flanqueados por unidades repetitivas 14 , 15 . A transcrição subsequente e o processamento de RNA geram pequenos RNAs 16 (CRRNAs) associados ao CRISPR que, juntamente com um CRRNA 17 (traRRNA) trans-ativador, se reúnem com a endonuclease efectora Cas9. Os crRNAs proporcionam assim especificidade ao alvo de Cas9, guiando o complexo para separar sequências de DNA viral complementares e prevenir novas infecções 18 , 19 . Qualquer sequência de "protospacer" no DNA alvo pode servir como fonte do crRNA, desde que seja diretamente 5 'para um motivo adjacente prótespacer curto (PAM), NGG no caso de S. pyogenes Cas9 <sUp class = "xref"> 20. A ausência da sequência PAM perto do espaçador no locus CRISPR do host distingue-se de si mesmo e não-auto, evitando a segmentação do hospedeiro. Devido à sua universalidade e flexibilidade, este sistema biológico foi poderosamente adaptado para a edição genômica, de modo que quase qualquer site de DNA adjacente ao PAM pode ser direcionado. Nesta versão, uma modificação adicional fundiu o crRNA e o tracrRNA em um único componente guia RNA (sgRNA) que é carregado na proteína Cas9 21 .
Após a expressão de Cas9 e um sgRNA em células eucarióticas, a proteína Cas9 corta as duas cadeias de DNA no locus alvo. Na ausência de uma região adequada de sequência homóloga, a célula corrige esta ruptura através de união final não homóloga (NHEJ) 22 , 23 , 24 , que tipicamente introduz pequenas deleções ou, raramente, inserções. Ao segmentar umQuadro de leitura, o reparo provavelmente leva a um quadro de translação que produz um produto proteico não funcional. Em contraste, quando fornecido com um modelo exógeno com grandes regiões de homologia, a célula pode corrigir a ruptura de duas vertentes por reparo direcionado por homologia 25 , 26 . Esta rota permite exclusões, substituições ou inserções precisas maiores no genoma, juntamente com a introdução de marcadores de seleção excisáveis 27 .
Aqui, apresentamos protocolos para gerar linhas celulares knockout por qualquer um desses dois métodos CRISPR / Cas9 ( Figura 1A ). A abordagem do NHEJ usa um único site de corte de sgRNA e rastreio independente de seleção e, portanto, requer pouca preparação antecipada. Ao usar este método, os RNAs de guia complementares aos exons próximos ao final 5 'da transcrição, que são mais propensos a produzir um knockout, devem ser projetados. Desde o modificatOs íons para o genoma neste caso são pequenos, a triagem para clones knockout baseia-se em manchas de ponto, onde o produto proteico é avaliado de forma eficiente. Utilizamos a geração de linhas knockout de proteína ELAV-like 1 (ELAVL1) como exemplo. A segunda abordagem baseia-se na reparação direta de homologia (HDR) e usa dois sites de corte de sgRNA que abrangem o gene ou região de interesse, permitindo deleções de dezenas de kb. Um plasmídeo com duas regiões de homologia que flanqueiam os sites de clivagem fornece um modelo de substituição ( Figura 1B ), introduzindo um marcador de resistência selecionável que aumenta a eficiência da geração de nocaute. Este método também pode ser adaptado para introduzir modificações de genes com armas de homologia devidamente projetadas. Neste caso, a integração de um novo fragmento de DNA permite a triagem baseada em PCR ( Figura 1C ). Aqui, usamos a geração de linhas knockout do membro da família Pumilio RNA vinculativo 2 (PUM2) como exemplo.
Protocol
Representative Results
Discussion
O sistema CRISPR / Cas9 permitiu uma geração eficiente de modificações genômicas estáveis, que proporcionam uma alternativa mais consistente a outros métodos de manipulação transitória. Aqui, apresentamos dois métodos para identificação rápida de knockouts de genes CRISPR / Cas9 em linhas celulares de mamíferos. Ambos os métodos requerem pouco material celular, pelo que o teste pode ser feito em estágios iniciais da cultura clonal, economizando tempo e reagentes. Para aumentar a eficiência de ambos os …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de reconhecer Gissell Sanchez, Megan Lee e Jason Estep para assistência experimental, e Weifeng Gu e Xuemei Chen por compartilhar reagentes.
Materials
| Competent E. coli cells | |||
| plasmid prep kit | |||
| pSpCas9(BB) plasmid | Addgene | 42230 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| BbsI enzyme | ThermoFisher | FD1014 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| Tango Buffer | ThermoFisher | BY5 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| Q5 hot start high fidelity polymerase | NEB | M0494A | HA amplification |
| pUC19-BsaI | Modified pUC19 plasmid, mutated existing BsaI site and inserted two outward facing BsaI sites after BamHI/EcoRI digestion | ||
| pGolden-Neo | Addgene | 51422 | Resistance cassette |
| pGolden-Hygro | Addgene | 51423 | Resistance cassette |
| BsaI enzyme | NEB | R3535S | Homology arm contruction |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | |
| Toothpicks | bacterial PCR | ||
| Taq polymerase | bacterial colony PCR | ||
| HEK293 human cells | |||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Corning | MT35010CV | |
| Penicillin-Strep (opt.) | Gibco | 15140-122 | |
| 6 well plates | BioLite | 12556004 | |
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2300 | for lipofection only |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | for lipofection only |
| G418 (Neomycin) | Sigma Aldrich | A1720-5G | |
| Hygromycin | Sigma Aldrich | H3274-250MG | |
| 96 well plates | ThermoFisher | 12556008 | |
| Passive Lysis Buffer, 5x | Promega | ||
| 1xSDS loading buffer | recipe decribed in protocol | ||
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| TBST | recipe decribed in protocol | ||
| Dehydrated milk | |||
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | for HRP-conjugated secondary antibodies |
| Extracta DNA prep for PCR | Quantabio | 95091-025 | |
| KOD polymerase | Novagen | 71316 |
References
- Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. 유전학. 188 (4), 773-782 (2011).
- Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1156-1160 (1996).
- Bibikova, M., et al. Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases. Mol Cell Biol. 21 (1), 289-297 (2001).
- Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. 유전학. 161 (3), 1169-1175 (2002).
- Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks. Mol Cell Biol. 23 (10), 3558-3565 (2003).
- Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
- Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
- Christian, M., et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. 유전학. 186 (2), 757-761 (2010).
- Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems. Annu Rev Microbiol. 69, 209-228 (2015).
- Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
- Karginov, F. V., Hannon, G. J. The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea. Mol Cell. 37 (1), 7-19 (2010).
- Wiedenheft, B., Sternberg, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
- Mojica, F. J., Diez-Villasenor, C., Garcia-Martinez, J., Soria, E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol. 60 (2), 174-182 (2005).
- Pourcel, C., Salvignol, G., Vergnaud, G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology. 151 (Pt 3), 653-663 (2005).
- Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321 (5891), 960-964 (2008).
- Deltcheva, E., et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 471 (7340), 602-607 (2011).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322 (5909), 1843-1845 (2008).
- Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
- Guirouilh-Barbat, J., et al. Impact of the KU80 pathway on NHEJ-induced genome rearrangements in mammalian cells. Mol Cell. 14 (5), 611-623 (2004).
- Moore, J. K., Haber, J. E. Cell cycle and genetic requirements of two pathways of nonhomologous end-joining repair of double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 16 (5), 2164-2173 (1996).
- Liang, F., Han, M., Romanienko, P. J., Jasin, M. Homology-directed repair is a major double-strand break repair pathway in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5172-5177 (1998).
- Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. 유전학. 196 (4), 961-971 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Luo, Y., Lin, L., Bolund, L., Sorensen, C. B. Efficient construction of rAAV-based gene targeting vectors by Golden Gate cloning. Biotechniques. 56 (5), 263-268 (2014).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).
