Urval-beroende och oberoende generering av CRISPR / Cas9-medierade genknockouts i däggdjursceller
Summary
Nya framsteg inom förmågan att genetiskt manipulera somatiska cellinjer har stor potential för grundläggande och tillämpad forskning. Här presenterar vi två tillvägagångssätt för CRISPR / Cas9 genererad knockoutproduktion och screening i däggdjurscellslinjer, med och utan användning av selekterbara markörer.
Abstract
CRISPR / Cas9 genomteknik systemet har revolutionerat biologi genom att tillåta exakt genom redigering med liten ansträngning. Styrs av en enda RNA-guide (sgRNA) som ger specificitet spjälkar Cas9-proteinet båda DNA-strängarna i det riktade locuset. DNA-pausen kan trigga antingen icke-homolog slutförslutning (NHEJ) eller homologeradriktad reparation (HDR). NHEJ kan introducera små raderingar eller infogningar som leder till ramförskjutningsmutationer, medan HDR möjliggör större och mer exakta störningar. Här presenterar vi protokoll för att generera knockoutcellinjer genom att koppla upp etablerade CRISPR / Cas9-metoder med två alternativ för nedströmsval / screening. NHEJ-tillvägagångssättet använder en enda sgRNA-cut-plats och selektionsoberoende screening, där proteinproduktion utvärderas med primär immunoblot på ett högt genomströmningsmöte. HDR-tillvägagångssättet använder två sgRNA-cut-platser som spänner över genen av intresse. Tillsammans med en tillhandahållen HDR-mall kan den här metoden uteslutasAv tiotals kb, med hjälp av den infogade selekterbara resistansmarkören. De lämpliga applikationerna och fördelarna med varje metod diskuteras.
Introduction
Stabila genetiska förändringar ger en fördel jämfört med övergående metoder för cellulär störning, som kan variera i effektivitet och varaktighet. Genomisk redigering har blivit allt vanligare de senaste åren på grund av utvecklingen av målspecifika nukleaser, såsom zinkfibre-nukleaser 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , transkriptionsaktivatorliknande effektornukleaser (TALEN) 6 , 7 , 8 , 9 Och RNA-styrda nukleaser härledda från de grupperade, regelbundna interspaced korta palindroma upprepningarna (CRISPR) -systemet 10 .
CRISPR / Cas9-redigeringsmaskinen är anpassad från ett immunsystem som bakterier och arkeor använder för att försvara sig mot virusinfektionerRöv = "xref"> 11 , 12 , 13 . I denna process inkorporeras korta 20-30 nt-fragment av invaderande virussekvens i ett genomiskt lokus som "distansorgan" flankerade av upprepande enheter 14 , 15 . Efterföljande transkription och RNA-behandling alstrar små CRISPR-associerade RNA 16 (crRNAs) som tillsammans med ett transaktiverande crRNA 17 (tracrRNA) samlas med effektorn Cas9-endonukleas. CrRNA: erna ger således specificitet mot Cas9-målsättning, styrning av komplexet för att klyva komplementära virala DNA-sekvenser och förhindra ytterligare infektioner 18 , 19 . Vilken som helst "protospacer" -sekvens i det riktade DNA kan tjäna som källa till crRNA, så länge som det är direkt 5 'till ett kort protospacer intilliggande motiv (PAM), NGG i fallet med S. pyogenes Cas9 <sUp class = "xref"> 20. Frånvaron av PAM-sekvensen nära avståndet i värdens CRISPR-locus skiljer sig mellan själv och icke-själv, vilket förhindrar inriktning av värden. På grund av dess universalitet och flexibilitet har detta biologiska system kraftigt anpassats för genomisk redigering, så att nästan vilken PAM-intilliggande DNA-plats som helst kan riktas. I denna version smälter en ytterligare modifiering av crRNA och tracrRNA i en enda styr-RNA (sgRNA) -komponent som laddas i Cas9-proteinet 21 .
Vid uttryck av Cas9 och ett sgRNA i eukaryota celler klyver Cas9-proteinet båda DNA-strängarna vid det riktade locuset. I frånvaro av en lämplig region av homolog sekvens fixar cellen denna paus via icke-homolog slutförslutning (NHEJ) 22 , 23 , 24 , som typiskt introducerar små deletioner eller sällan insättningar. När du riktar in en öppenLäsramen leder reparationen sannolikt till en translationell ramskift som producerar en icke-funktionell proteinprodukt. I motsats därtill kan cellen, när den förses med en exogen mall med stora homologiska områden, fixera dubbelsträngsprickningen genom homologinriktad reparation 25 , 26 . Denna väg möjliggör större exakta deletioner, ersättningar eller insertioner i genomet, i kombination med införandet av excisabla markeringsmarkörer 27 .
Här presenterar vi protokoll för att generera knockoutcellinjer genom någon av dessa två CRISPR / Cas9-metoder ( Figur 1A ). NHEJ-tillvägagångssättet använder en enda sgRNA-cut-plats och urval oberoende screening, och kräver sålunda liten förberedelse framåt. När du använder den här metoden, vägleda RNA som är komplementära till exoner nära 5'-änden av transkriptet, vilket sannolikt kommer att producera en knockout, måste utformas. Sedan modificatJoner till genomet i detta fall är små, screening för knockout-kloner baseras på punktfläckar, där proteinprodukten utvärderas på ett högt genomströmningsmöte. Vi använder generationen av ELAV-liknande 1 protein (ELAVL1) knockout-linjer som ett exempel. Det andra tillvägagångssättet är beroende av homologeradriktad reparation (HDR) och använder två sgRNA-cut-platser som spänner över genen eller regionen av intresse, vilket möjliggör borttagning av tiotals kb. En plasmid med två regioner av homologi som flankerar klyvningsställena tillhandahåller en ersättningsmall ( Figur 1B ), introducerande en selekterbar resistansmarkör som ökar effektiviteten av knockout-generationen. Denna metod kan också anpassas för att introducera genmodifieringar med korrekt utformade homologiska armar. I detta fall möjliggör integrationen av ett nytt DNA-fragment för PCR-baserad screening ( Figur 1C ). Här använder vi generationen av Pumilio RNA-bindande familjemedlem 2 (PUM2) knockout-linjer som ett exempel.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR / Cas9-systemet har möjliggjort effektiv generation av stabila genomiska modifieringar, vilket ger ett mer konsekvent alternativ till andra övergående manipuleringsmetoder. Här har vi presenterat två metoder för snabb identifiering av CRISPR / Cas9 gen-knockouts i däggdjurscellinjer. Båda metoderna kräver litet cellulärt material, så testning kan ske i tidiga stadier av klonalkultur, vilket sparar tid och reagenser. För att öka effektiviteten hos båda metoderna rekommenderar vi att testa flera sgRNA…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna skulle vilja erkänna Gissell Sanchez, Megan Lee och Jason Estep för experimentell hjälp, och Weifeng Gu och Xuemei Chen för att dela reagenser.
Materials
| Competent E. coli cells | |||
| plasmid prep kit | |||
| pSpCas9(BB) plasmid | Addgene | 42230 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| BbsI enzyme | ThermoFisher | FD1014 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| Tango Buffer | ThermoFisher | BY5 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| Q5 hot start high fidelity polymerase | NEB | M0494A | HA amplification |
| pUC19-BsaI | Modified pUC19 plasmid, mutated existing BsaI site and inserted two outward facing BsaI sites after BamHI/EcoRI digestion | ||
| pGolden-Neo | Addgene | 51422 | Resistance cassette |
| pGolden-Hygro | Addgene | 51423 | Resistance cassette |
| BsaI enzyme | NEB | R3535S | Homology arm contruction |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | |
| Toothpicks | bacterial PCR | ||
| Taq polymerase | bacterial colony PCR | ||
| HEK293 human cells | |||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Corning | MT35010CV | |
| Penicillin-Strep (opt.) | Gibco | 15140-122 | |
| 6 well plates | BioLite | 12556004 | |
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2300 | for lipofection only |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | for lipofection only |
| G418 (Neomycin) | Sigma Aldrich | A1720-5G | |
| Hygromycin | Sigma Aldrich | H3274-250MG | |
| 96 well plates | ThermoFisher | 12556008 | |
| Passive Lysis Buffer, 5x | Promega | ||
| 1xSDS loading buffer | recipe decribed in protocol | ||
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| TBST | recipe decribed in protocol | ||
| Dehydrated milk | |||
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | for HRP-conjugated secondary antibodies |
| Extracta DNA prep for PCR | Quantabio | 95091-025 | |
| KOD polymerase | Novagen | 71316 |
References
- Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).
- Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1156-1160 (1996).
- Bibikova, M., et al. Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases. Mol Cell Biol. 21 (1), 289-297 (2001).
- Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
- Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks. Mol Cell Biol. 23 (10), 3558-3565 (2003).
- Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
- Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
- Christian, M., et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics. 186 (2), 757-761 (2010).
- Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems. Annu Rev Microbiol. 69, 209-228 (2015).
- Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
- Karginov, F. V., Hannon, G. J. The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea. Mol Cell. 37 (1), 7-19 (2010).
- Wiedenheft, B., Sternberg, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
- Mojica, F. J., Diez-Villasenor, C., Garcia-Martinez, J., Soria, E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol. 60 (2), 174-182 (2005).
- Pourcel, C., Salvignol, G., Vergnaud, G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology. 151 (Pt 3), 653-663 (2005).
- Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321 (5891), 960-964 (2008).
- Deltcheva, E., et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 471 (7340), 602-607 (2011).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322 (5909), 1843-1845 (2008).
- Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
- Guirouilh-Barbat, J., et al. Impact of the KU80 pathway on NHEJ-induced genome rearrangements in mammalian cells. Mol Cell. 14 (5), 611-623 (2004).
- Moore, J. K., Haber, J. E. Cell cycle and genetic requirements of two pathways of nonhomologous end-joining repair of double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 16 (5), 2164-2173 (1996).
- Liang, F., Han, M., Romanienko, P. J., Jasin, M. Homology-directed repair is a major double-strand break repair pathway in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5172-5177 (1998).
- Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Luo, Y., Lin, L., Bolund, L., Sorensen, C. B. Efficient construction of rAAV-based gene targeting vectors by Golden Gate cloning. Biotechniques. 56 (5), 263-268 (2014).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).
