यह काम एक परिपक्व माउस टी-सेल लाइन का उपयोग करके क्रोमैटिन इम्युनोपेरेग्रेशन (चिप) के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। यह प्रोटोकॉल विशिष्ट प्रमोटर साइटों या जीनोम-वाइड पर विशिष्ट हिस्टोन अंकों के वितरण की जांच के लिए उपयुक्त है।
सिग्नलिंग पथ, अलग-अलग स्तरों पर क्रोमेटिन संरचना के मॉड्यूलेशन के माध्यम से जीन एक्सप्रेशन कार्यक्रमों को विनियमित करते हैं, जैसे कि हिस्टोन पूंछ के बाद-अनुवादित संशोधनों (पीटीएम), हिस्टोन वेरिएंट के साथ कैनोनिकल हिस्टोन का आदान-प्रदान, और न्यूक्लियोसोम बेदखली। ऐसे विनियमन के लिए संकेत-संवेदनशील प्रतिलेखन कारकों (टीएफ) की बाध्यकारी आवश्यकता होती है जो कि उच्चवर्धक के रूप में परिभाषित नियामक तत्वों पर क्रोमैटीन-संशोधित एंजाइमों की भर्ती करते हैं। समझ कैसे संकेतन कैसकेड अनुवर्ती गतिविधि को विनियमित करने के लिए टीएफ के बंधन, क्रोमैटिन संशोधित एंजाइमों और विशिष्ट हिस्टोन अंकों और हिस्टोन वेरिएंट के अधिभोग के लिए व्यापक विश्लेषण की आवश्यकता है। क्रोमैटिन इम्युनोपेरेग्रेशन (चिप) एसेज विशिष्ट प्रोटीन / डीएनए कॉम्प्लेक्स को अनियंत्रित करने के लिए अत्यधिक विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करता है। शुद्ध डीएनए के बाद के विश्लेषण में एंटीबॉडी द्वारा मान्यता प्राप्त प्रोटीन द्वारा कब्जा कर लिया क्षेत्र की पहचान के लिए अनुमति देता है। यह काम कुशलतापूर्वक पे के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता हैएक परिपक्व माउस टी-सेल लाइन में हिस्टोन प्रोटीन की चप्पे चीप प्रस्तुत प्रोटोकॉल चिप अवधि के उचित समय-सीमा में और उच्च प्रजनन क्षमता के साथ प्रदर्शन के लिए अनुमति देता है।
विकास, भेदभाव, और होमोस्टैसिस विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति कार्यक्रमों पर निर्भर करते हैं जो कि सिग्नलिंग इवेंट से स्थापित होते हैं जो क्रोमैटिन संरचना को विनियमित करते हैं और इसलिए निर्धारित करते हैं कि किसी विशिष्ट जीन को सक्रिय किया जाता है या सेल-और समय-विशिष्ट तरीके से दमन होता है या नहीं। टी-सेल के विकास के दौरान, टी-सेल के अग्रदूतों के परिप्रेक्ष्य को एक-पॉजिटिव (एसपी) राज्य में डबल-नेगेटिव (डीएन) से परिपक्व होने के लिए विशिष्ट जीन एक्सप्रेशन प्रोग्राम स्थापित किए जाने चाहिए, जो कि कई मध्यवर्ती अवस्थाएं 1 से गुजरती हैं। टी सेल विकास के दौरान गतिशील रूप से विनियमित जीन अभिव्यक्ति कार्यक्रम को पिछले वर्षों में मोटे तौर पर कई प्रयोगशालाओं 2 , 3 , 4 , 5 , 6 द्वारा जांच की गई है ।
हिस्टोन्स के बाद-अनुवादित संशोधनों (पीटीएम) द्वारा, एक्सचेंजहिस्टोन वेरिएंट, न्यूक्लियोसोम बेदखली के साथ कैनोनिकल हिस्टोन, और डीएनए मेथिलैलेशन जीन के ऑन / ऑफ स्विच को विनियमित करते हैं। कई समूहों ने पीटीएम और हिस्टोन वेरिएंट्स के जीनोम-विस्तृत वितरण का पता लगाया है जो अलग-अलग क्रोमेटिन के साथ संबद्ध हैं, जो 7 , 8 , 9 , 10 के दोनों समीपस्थ और बाह्य विनियामक क्षेत्रों में हैं। सिग्नलिंग कैसकेड विशिष्ट बढ़ाने वाले तत्वों पर सकारात्मक और नकारात्मक क्रोमैटिन-संशोधित एंजाइमों के आदान-प्रदान के माध्यम से गतिशील क्रोमेटिन विनियमन (जिसे क्रोमैटिन संशोधक भी कहा जाता है) का आयोजन करता है। ये क्रोमैटिन संशोधक क्रोमैटिन संरचना को विनियमित करते हैं और इस प्रकार ट्रांसक्रिप्शनल आउटपुट द्वारा, उदाहरण के लिए, गतिशील हिस्टोन मेथिलैशन और एसिटिलेशन। यह निशान सिग्नलिंग मार्ग 11 , 12 , 13 ,14
गतिशील हिस्टोन PTMs; हिस्टोन वेरिएंट के साथ एक्सचेंज; और हिस्टोन, ट्रांसक्रिप्शन कारकों और कॉफ़ैक्टर्स के गतिशील अधिभोग की जांच क्रोमैटिन इम्युनोपेरेग्रेशन (चिप) एसेल्स द्वारा की जा सकती है। अति विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग विशिष्ट डीएनए-प्रोटीन परिसरों को शुद्ध करने के लिए किया जाता है, और शुद्ध डीएनए का मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) द्वारा विश्लेषण किया जाता है; गहरे क्रमिक (चिप-सेक); या, आजकल कम बार, माइक्रोएरे (चिप-चिप) को संकरण।
कोशिकाओं के विश्लेषण, क्रोमैटिन के कवच और / या एंटीबॉडी के निम्न विशिष्टता के साथ जटिलताओं के कारण चिप आर्च कभी-कभी चुनौती होती है। प्रोटोकॉल में सुधार के लिए कई रणनीतियों को अपनाया गया है, जैसा कि नेक्ससॉन 15 के मामले में है शीतलक जल-स्नान ध्वनियों का उपयोग नमूना हीटिंग से बचा जाता है जो जांच के तहत प्रोटीन पर मौजूद एपिटोप्स को नुकसान पहुंचा सकता है, लेकिन नमूनों की कतरनी के लिए जरूरी ऊर्जा को पानी में फैला दिया जाता है।ऊर्जा के फैलाव को रोकने वाले केंद्रित अल्ट्रासोनिक उपकरणों के विकास के साथ एक और सुधार किया गया था। इसलिए, ध्यान केंद्रित ultrasonicator उपकरणों सेल lysis और chromatin कर्तन में सुधार के लिए अनुमति देते हैं, ऑपरेटर प्रेरित विविधताओं को नष्ट करने और महत्वपूर्ण रूप से reproducibility बढ़ रही है।
यह काम ईटीपीएचए 16 , 17 नामक एक परिपक्व माउस टी-सेल लाइन में हिस्टोन प्रोटीन के चिप को कुशलतापूर्वक करने के लिए प्रोटोकॉल ( चित्रा 1 में योजनाबद्ध अवलोकन) का वर्णन करता है। आमतौर पर टी कोशिकाओं को बोलना मुश्किल होता है, और उनके क्रोमैटिन के कवच को अक्षम होने का पता चला है। इस प्रोटोकॉल में, जो एक ठंडा ध्यान केंद्रित ultrasonicator का उपयोग करता है, कोशिकाओं की संख्या, lysis बफर, और कर्तन की स्थापना E2-10HA माउस T- सेल लाइन के लिए अनुकूलित थे यह प्रोटोकॉल एक उच्च प्रजनन क्षमता और उचित समय के साथ चिप को करने की अनुमति देता है। वास्तव में, यह requirक्रोमेटिन को कतरनी करने के लिए लगभग दो दिन और कर्तन की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए, और तीन दिनों में इम्यूनोपेरैजैज करने के लिए, क्रॉस्लिंक को उलट करें और डीएनए शुद्ध करें।
चिप एक विशिष्ट तकनीक है जो जांच कर रहा है कि प्रोटीन या उनके पीटीएम विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्रों में समृद्ध हैं या नहीं। चिप परख परिणाम अक्सर जैविक या तकनीकी कारणों की वजह से व्याख्या करने के लिए चुनौतीपूर्ण होते हैं। जैविक कारण बहुत से होते हैं और इसमें डीएनए के लिए प्रोटीन की कमजोर या अप्रत्यक्ष बंधन शामिल है। इसमें तकनीकी सीमाएं भी हैं, जैसे कि सीमित एंटीबॉडी विशिष्टता और अक्षम सेल सेल या लिपटाइन की मात्रा। एक समस्या निवारण गाइड ( तालिका 5 ) रीढ़ की हड्डी के साथ समस्याओं का समाधान करने के लिए पाठक को मदद कर सकता है।
यह प्रोटोकॉल, शीतलन केंद्रित ultrasonicator डिवाइस का उपयोग करता है, जिससे कि एक परिपक्व माउस T-cell लाइन के क्रोमेटिन को कुशलतापूर्वक कतरनी की अनुमति देता है। प्रोटोकॉल का मुख्य महत्वपूर्ण चरण क्रोमेटिन के कवच द्वारा दर्शाया जाता है, जिसे हमेशा प्रत्येक सेल प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। यह कोशिकाओं की संख्या और सोनिक चक्र की संख्या भिन्न करने का सुझाव दिया गया है। इसके अलावा, वह एसडीएस की उपस्थिति से नकारात्मक प्रभाव पड़ता है, जो नमूनों में प्रक्षेपित होता है, जो एसडीएस बिसर के साथ बर्फ पर कोशिकाओं के विश्लेषण के दौरान हो सकता है। इस मामले में, एसडीएस की उपस्थिति को कम करने के लिए कुछ मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एलिसेशन के बाद नमूना सेवन करना सबसे अच्छा होता है। यह प्रोटोकॉल को 200 से 500 बीपी के बीच शेड टुकड़े प्राप्त करने और इम्युनोपेरैगिज के साथ आगे बढ़ने से पहले नमूने की कतरनी की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए अनुशंसित है। इसके अतिरिक्त, निर्धारण समय, एंटीबॉडी और / या कोशिकाओं की मात्रा, और धोने की स्थिति को प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
चिप प्रक्रिया सफल बनाने में एक और महत्वपूर्ण कदम एंटीबॉडी का विकल्प है, क्योंकि कम विशिष्टता वाले एंटीबॉडी ने इम्युनोपेरेएबजी की दक्षता को काफी कम कर दिया है। इससे पहले, बाजार में उपलब्ध कई एंटीबॉडी की विशिष्टता के मूल्यांकन के लिए एक एकीकृत गुणवत्ता परीक्षण प्रक्रिया की अनुमति दी गई थी Ss = "xref"> 1 9 स्क्रीनिंग पाइप लाइन, डॉट ब्लोट, वेस्टर्न ब्लॉट, और चिप पर आधारित थी, जिसमें चिप 19 के लिए उपयुक्त उच्च गुणवत्ता वाला अभिकर्मकों की सूची उपलब्ध है। हाल ही में, कई वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी की विशिष्टता का मूल्यांकन उच्च घनत्व हिस्टोन पेप्टाइड माइक्रोएरे प्लेटफार्मों के द्वारा किया गया था, जो कि एंटीबॉडी विशिष्टता 20 पर एक डेटाबेस की स्थापना के लिए अनुमति देता है। चिपर प्रयोगों के लिए उपयोग किए जा सकने वाले सबसे विशिष्ट एंटीबॉडी की पहचान करने के लिए रीडर इस उपयोगी उपकरण का उपयोग कर सकते हैं।
इस प्रोटोकॉल को प्राथमिक टी-कोशिकाओं के लिए परीक्षण नहीं किया गया है और, इस मामले में, पाठक को अन्य प्रकाशित प्रोटोकॉल का उल्लेख करना चाहिए जो सफलतापूर्वक प्राथमिक टी-कोशिकाओं 3 , 4 , 21 पर चिप का प्रदर्शन कर रहे हैं। विशेष रूप से, यह प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक माउस उत्प्रेरक टी सेल लाइन पर चिप के साथ-साथ माउस एंडोथेलियल सेल लाइन पर भी प्रदर्शन करने के लिए उपयोग किया गया है।
Ove_content "> 5 x 10 6 कोशिकाओं को हिस्टोन अंकों के विश्लेषण के लिए प्रत्येक immunoprecipitation के लिए उपयोग किया जाना चाहिए। क्योंकि यह प्रोटोकॉल कुछ ऑप्टिमाइज़ेशन के साथ, TFs या cofactors पर चिप करने के लिए उपयुक्त भी हो सकता है, यह कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि करना सबसे अच्छा है इन मामलों में immunoprecipitation के लिए उपयोग किया जाता है। प्रत्येक प्रयोग के लिए आवश्यक संख्या में कोशिकाओं तक पहुंचने के लिए, कमजोर पड़ने वाले बफर में क्रोमेटिन को कम करने से पहले शेयर्ड लाइसेट के अधिक अलोकुट को एक साथ जमा किया जा सकता है।डीएनए को सीधे बाँध नहीं करते हैं जो अंतर्जात प्रोटीन पर चिप करने के लिए इस प्रोटोकॉल को संशोधित किया जा सकता है। इस मामले में, प्रोटीन-प्रोटीन क्रॉटलिंकर्स ( जैसे, डाइमिथाइल एडिपिमिडेट, डीएमए) के साथ पूर्व-निर्धारण की आवश्यकता हो सकती है (अधिक जानकारी के लिए परिशिष्ट बी देखें)। कॉफ़ेक्टर्स पर चिप के सफल प्रदर्शन को पहले से ही प्रोटीनों के बायोटीन-टैग में लगाए जाने वाले प्रोटीनों द्वारा किया गया था। इस मामले में, प्रोटीन को स्ट्रेक्टिविडिन-कंजुगा से शुद्ध किया गया थाटेड चुंबकीय मोतियों, और डीएमए के साथ एक पूर्व निर्धारण 22 प्रदर्शन किया था।
The authors have nothing to disclose.
उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए हम पी। केस और टी। श्मिट-वॉल का आभारी हैं। यह काम सहयोगी अनुसंधान अनुदान TRR81 और डीएफ़जी (जर्मन अनुसंधान फाउंडेशन), मैक्स प्लैंक सोसायटी और फ्रीबर्ग में एसीसी 2 9 4 के हाइजेनबर्ग कार्यक्रम (बीओ 1639 / 5-1) और कार्डियो पल्मोनरी सिस्टम के लिए उत्कृष्टता क्लस्टर द्वारा समर्थित था (ईसीसीपीएस) जीएससेन में टीबी
Agilent High Sensitivity D5000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5593 | |
Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5592 | |
Agilent Tapestation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | |
Covaris S220 AFA System | Covaris | 500217 | |
dimethyl adipimidate (DMA) | Thermo Fisher Scientific | 20660 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Pan-Biotech | 1502-P121301 | |
Formaldehyde (FMA) | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21980-032 | |
Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
nProtein A Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5280-02 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
Peptone primatone | Sigma-Aldrich | P4963-100G | |
Phase Lock Gel Heavy 2 ml | 5 Prime | 2302830 | |
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Roth | A156.2 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | GIBCO | 14190-094 | |
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | |
Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
Tube AFA Fiber & Cap | Covaris | 520081 |