JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
생화학

Analyse af histonantistofspecifikitet med peptidmikroarrays

Published: August 01, 2017
doi:
10.3791/55912
, ,
1Center for Epigenetics,Van Andel Research Institute

Summary

Dette manuskript beskriver metoder til anvendelse af peptidmikraariteknologi til specificitetsprofilering af antistoffer, der genkender histoner og deres posttranslationelle modifikationer.

Abstract

Post-translationelle modifikationer (PTM'er) på histonproteiner studeres bredt for deres roller i regulering af kromatinstruktur og genekspression. Masseproduktionen og distributionen af ​​antistoffer, der er specifikke for histon-PTM'er, har i høj grad lettet forskningen på disse mærker. Da histon-PTM-antistoffer er nøglereagenser til mange kromatinbiokemiske applikationer, er streng analyse af antistofspecificitet nødvendig for nøjagtig datatolkning og fortsatte fremskridt på området. Denne protokol beskriver en integreret pipeline til design, fabrikation og anvendelse af peptidmikroarrays til profilering af specificiteten af ​​histonantistoffer. Design og analyse aspekter af denne procedure er lettet af ArrayNinja, en open source og interaktiv softwarepakke, vi for nylig udviklede for at strømline tilpasningen af ​​microarray printformater. Denne rørledning er blevet brugt til at screene et stort antal kommercielt tilgængelige og almindeligt anvendte histon PTM antibodiesS, og data genereret fra disse eksperimenter er frit tilgængelige via en online og udvidende Histone Antibody Specificity Database. Ud over histoner kan den generelle fremgangsmåde beskrevet heri anvendes bredt til analysen af ​​PTM-specifikke antistoffer.

Introduction

Genomisk DNA pakkes elegant inde i den eukaryote cellekerne med histonproteiner til dannelse af chromatin. Den gentagne underenhed af kromatin er nukleosomet, som består af 147 basepar af DNA viklet omkring en octamer kerne af histonproteiner – H2A, H2B, H3, og H4 1. Kromatin er bredt organiseret i løst pakket eukromatin og tæt pakket heterochromatin domæner. Graden af ​​chromatin-komprimering regulerer i hvilket omfang proteinindustrien kan få adgang til det underliggende DNA til at udføre grundlæggende DNA-templaterede processer som replikation, transkription og reparation.

Nøgleregulatorer for genometilgængelighed i forbindelse med chromatin er PTM'er på de ustrukturerede hale- og kerneområder af histonproteiner 2 , 3 . Histon-PTM'er virker direkte ved at påvirke strukturen af ​​chromatin 4 og indirekte througH rekruttering af læserproteiner og deres tilhørende makromolekylære komplekser, der har kromatin remodeling, enzymatisk og stilladsaktiviteter 5 . Undersøgelser af histon-PTM-funktion i løbet af de sidste to årtier tyder på overvejende, at disse mærker spiller nøglerolle i regulering af celleforebyggelse, organisationsudvikling og sygdomsinitiering / progression. Fueled af fremskridt i massespektrometri-baseret proteomteknologi er der fundet mere end 20 unikke histon-PTM'er på mere end 80 forskellige histonrester 6 . Navnlig forekommer disse modifikationer ofte i kombinationer og i overensstemmelse med "histonkode" -hypotesen, viser talrige undersøgelser, at læserproteiner er målrettet mod diskrete regioner af chromatin ved genkendelse af specifikke kombinationer af histon-PTM'er 7 , 8 , 9 . En vigtig udfordring fremadrettet vil være at tildele funktioner til grSkyldige liste over histon-PTM'er og at bestemme, hvordan specifikke kombinationer af histon-PTM'er orkestrerer de dynamiske funktioner, der er forbundet med chromatin.

Antistoffer er lynchpinreagenser til påvisning af histon-PTM'er. Som sådan er mere end 1000 histon-PTM-specifikke antistoffer blevet udviklet kommercielt til anvendelse i kromatinbiokemiforskning. Med den hurtige udvikling af DNA-sekventeringsteknologi med høj gennemstrømning anvendes disse reagenser i vid udstrækning af individuelle efterforskere og omfattende epigenomiske "køreplan" -initiativer ( f.eks . ENCODE og BLUEPRINT) i ChIP-seq (chromatinimmunpræcipitation kombineret med næste generations sekventering ) Rørledninger til at generere højopløselige rumlige kort af histon PTM-fordelingsgenet bredt 10 , 11 . Nylige undersøgelser har imidlertid vist, at specificiteten af ​​histon-PTM-antistoffer kan være meget variabel, og at disse reagenser udviser uegnede Dyrebare egenskaber som off-target-epitopgenkendelse, stærk positiv og negativ indflydelse fra nabo-PTM'er og vanskeligheder med at diskriminere modifikationsordren på en bestemt rest ( fx mono-, di- eller trimethyllysin) 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Derfor er streng kvalitetskontrol af histon PTM-specifikke antistofreagenser nødvendigt for nøjagtigt at fortolke data genereret med disse værdifulde reagenser.

Microarray-teknologien muliggør samtidig forespørgsel af tusindvis af makromolekylære interaktioner i et gennemgående, reproducerbart og miniaturiseret format. Af denne årsag er der blevet udviklet en række mikroarrayplatforme til analyse af protein-DNA 19 ,"> 20, proteinprotein 21 og proteinpeptid-interaktioner 22. Faktisk er histonpeptidmikroarrays fremkommet som en informativ opdagelsesplatform for chromatin biokemiforskning, der muliggør højprofilering af forfattere, viskelæder og læsere af histon PTM'er 15 , 23, 24, og også til analyse af histon antistofspecificitet 17, 25. Beyond deres anvendelse i kromatin og epigenetik forskning, histon peptidarrays har potentiel anvendelighed som en diagnostisk / prognostisk test for systemisk lupus erythematosus og andre autoimmune sygdomme, hvor anti- Chromatin autoantistoffer er dannet 26 , 27 .

Her beskriver vi en integreret rørledning, som vi har udviklet til design, fremstilling og køRying histone peptid microarrays at generere specificitet profiler for antistoffer, der genkender histoner og deres PTMs. Rørledningen understøttes af ArrayNinja, en open source, interaktiv software applikation, som vi for nylig udviklede, som integrerer design- og analysestadierne i microarray eksperimenter 28 . ArrayNinja virker bedst i Google Chrome. Kort fortalt anvendes en robotkontakt-mikroarray printer til at deponere et bibliotek af biotinkonjugerede histonpeptider i definerede positioner på streptavidin-coatede glasmikroskop dias. Arrays kan derefter anvendes i et konkurrencedygtigt og parallelt assayformat for at forhøre antistof-epitopinteraktioner ( Figur 1 ). Peptidbiblioteket består af hundredvis af unikke syntetiske peptider, der indeholder PTM'er (lysinacetylering, lysin / argininmethylering og serin / threoninphosphorylering) alene og i relevante kombinationer, der stort set er afledt af proteomiske datasæt. Metoder til peptidsyntese og validering Er beskrevet andetsteds 23 . Data genereret fra vores igangværende histone PTM antistof screening indsats udnytter denne array platform er arkiveret på en offentlig web ressource, Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com). Især er histonpeptidmikroarrays fremstillet med variationer af denne protokol også blevet anvendt i vid udstrækning for at karakterisere aktiviteten af ​​histon PTM-læserdomænerne 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 og mere for nylig til profilering af histon PTM forfatter og viskelæder 24 .

/files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg "/>
Figur 1: Tegneserieafbildning af den trinvise procedure til antistof screening på en histonpeptid-mikroarray. Biotinylerede histonpeptider med definerede posttranslationelle modifikationer (røde og blå cirkler) er trykt med biotin-fluorescein på streptavidin-belagt glas. Positive interaktioner visualiseres som rød fluorescens. Klik her for at se en større version af denne figur.

Protocol

1. Installere og køre ArrayNinja Download og installer Oracle Virtual Box fra www.virtualbox.org. Download og komprimer ArrayNinja virtuelle maskine (VM) fra http://research.vai.org/Tools/arrayninja. Åbn Virtual Box og tilføj ArrayNinja VM ved at klikke på 'Maskine', 'Tilføj' og vælg arrayninja.vbox fra den mappe, hvor ArrayNinja VM blev gemt. Start ArrayNinja ved at vælge det inde i Virtual Box og klikke på den grønne "start" -pile. V…

Representative Results

Denne protokol er blevet anvendt til at designe og fremstille en peptid-mikroarrayplatform til analyse af histon-PTM-antistofspecificitet. Arrayet spørger om et bibliotek med mere end 300 unikke peptidfunktioner (20-40 rester i længden), der repræsenterer mange af de kendte kombinationer af PTM'er, der findes på kerne- og varianthistonproteiner 38 . Denne rørledning har været en arbejdshest for screeningen af ​​mange almindeligt anvendte og kommercie…

Discussion

Antistofens pålidelighed i biomedicinske forskningsapplikationer er afgørende 46 , 47 . Dette gælder især i kromatinbiokemi givet antistoffernes position som nøgleværktøjer til de fleste teknikker, der er udviklet til at karakterisere overfladen og fordelingen af ​​histon-PTM'er. Protokollen præsenterede her detaljer en optimeret pipeline til design, fabrikation og anvendelse af peptidmikroarrays for at analysere histon PTM antistofspecificitet. …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev delvist støttet af Van Andel Research Institute og et forskningsbidrag fra National Institutes of Health (CA181343) til SBR

Materials

Printing Buffer ArrayIt PPB
BSA Omnipure 2390
Streptavidin-coated glass microscope slides Greiner Bio-one 439003-25
polypropylene 384 well plate Greiner Bio-one 784201
Biotin-fluorescein Sigma 53608
contact microarray printer Aushon 2470 Aushon 2470 Microarray Printer
contact microarray printer Gene Machines OmniGrid 100 OmniGrid Microarray Printer
PBS Invitrogen 14190
Blocking Buffer ArrayIt SBB
Hydrophobic wax pen Vector Labs H-4000 ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen
Silicon Gasket Grace Bio-labs 622511
Hybridization Vessel Thermo Scientific 267061 or similar vessel
Fluorescent-dye conjugated secondary antibody Life Technologies A-21244 Alexa Fluor 647 (anti-rabbit)
Fluorescent-dye conjugated secondary antibody Life Technologies A-21235 Alexa Fluor 647 (anti-mouse)
Wax Imprinter ArrayIt MSI48
Tween-20 Omnipure 9490
Microarray Scanner Innopsys InnoScan 1100AL or equivalent microarray scanner
EipTitan Histone Peptide Microarray Epicypher 112001
AbSurance Pro Histone Peptide Microarray Millipore 16668
MODified Histone Peptide Array Active Motif 13001
Histone Code Peptide Microarrays JPT His_MA_01
Wax Royal Oak GulfWax for wax imprinter
Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber VWR 97000-284
High throughput microscope slide washing chamber ArrayIt HTW
Microscope slide centrifuge VWR 93000-204
Antibody 1 Abcam 8898
Antibody 2 Millipore 07-473
Biotinylated histone peptide EpiCypher 12-0001 Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources.
ImageMagick https://www.imagemagick.org/script/index.php
ArrayNinja https://rothbartlab.vai.org/tools/
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Steensel, B. Chromatin: constructing the big picture. EMBO J. 30 (10), 1885-1895 (2011).
  2. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  3. Rothbart, S. B., Strahl, B. D. Interpreting the language of histone and DNA modifications. Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 627-643 (2014).
  4. Shogren-Knaak, M., Ishii, H., Sun, J. -. M., Pazin, M. J., Davie, J. R., Peterson, C. L. Histone H4-K16 acetylation controls chromatin structure and protein interactions. Science. 311 (5762), 844-847 (2006).
  5. Musselman, C. A., Lalonde, M. -. E., Côté, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
  6. Huang, H., Sabari, B. R., Garcia, B. A., Allis, C. D., Zhao, Y. SnapShot: Histone Modifications. Cell. 159 (2), 458 (2014).
  7. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  8. Rothbart, S. B., Krajewski, K., et al. Association of UHRF1 with methylated H3K9 directs the maintenance of DNA methylation. Nat Struct Mol Biol. 19 (11), 1155-1160 (2012).
  9. Wang, Z., Zang, C., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nat Genet. 40 (7), 897-903 (2008).
  10. Stunnenberg, H. G., Hirst, M. The International Human Epigenome Consortium: A Blueprint for Scientific Collaboration and Discovery. Cell. 167 (5), 1145-1149 (2016).
  11. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  12. Egelhofer, T. A., Minoda, A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
  13. Bock, I., Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Brandt, O., Rathert, P., Jeltsch, A. Detailed specificity analysis of antibodies binding to modified histone tails with peptide arrays. Epigenetics. 6 (2), 256-263 (2011).
  14. Busby, M., Xue, C., et al. Systematic comparison of monoclonal versus polyclonal antibodies for mapping histone modifications by ChIP-seq. Epigenetics Chromatin. 9, 49 (2016).
  15. Fuchs, S. M., Krajewski, K., Baker, R. W., Miller, V. L., Strahl, B. D. Influence of combinatorial histone modifications on antibody and effector protein recognition. Curr Biol. 21 (1), 53-58 (2011).
  16. Kungulovski, G., Jeltsch, A. Quality of histone modification antibodies undermines chromatin biology research. F1000Research. 4, 1160 (2015).
  17. Rothbart, S. B., Dickson, B. M., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
  18. Rothbart, S. B., Lin, S., et al. Poly-acetylated chromatin signatures are preferred epitopes for site-specific histone H4 acetyl antibodies. Sci Rep. 2, 489 (2012).
  19. Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nat Protoc. 4 (3), 393-411 (2009).
  20. Hu, S., Wan, J., et al. DNA methylation presents distinct binding sites for human transcription factors. eLife. 2, e00726 (2013).
  21. Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. Applications in high-content functional protein microarrays. Curr Opin Chem Biol. 30, 21-27 (2016).
  22. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289 (5485), 1760-1763 (2000).
  23. Rothbart, S. B., Krajewski, K., Strahl, B. D., Fuchs, S. M. Peptide microarrays to interrogate the “histone code” . Methods Enzymol. 512, 107-135 (2012).
  24. Cornett, E. M., Dickson, B. M., et al. Substrate Specificity Profiling of Histone-Modifying Enzymes by Peptide Microarray. Methods Enzymol. 574, 31-52 (2016).
  25. Nady, N., Min, J., Kareta, M. S., Chédin, F., Arrowsmith, C. H. A SPOT on the chromatin landscape? Histone peptide arrays as a tool for epigenetic research. Trends Biochem Sci. 33 (7), 305-313 (2008).
  26. Dieker, J., Berden, J. H., et al. Autoantibodies against Modified Histone Peptides in SLE Patients Are Associated with Disease Activity and Lupus Nephritis. PLoS ONE. 11 (10), (2016).
  27. Price, J. V., Tangsombatvisit, S., et al. “On silico” peptide microarrays for high-resolution mapping of antibody epitopes and diverse protein-protein interactions. Nat Med. 18 (9), 1434-1440 (2012).
  28. Dickson, B. M., Cornett, E. M., Ramjan, Z., Rothbart, S. B. ArrayNinja: An Open Source Platform for Unified Planning and Analysis of Microarray Experiments. Methods Enzymol. 574, 53-77 (2016).
  29. Gatchalian, J., Fütterer, A., et al. Dido3 PHD modulates cell differentiation and division. Cell Rep. 4 (1), 148-158 (2013).
  30. Cai, L., Rothbart, S. B., et al. An H3K36 methylation-engaging Tudor motif of polycomb-like proteins mediates PRC2 complex targeting. Mol Cell. 49 (3), 571-582 (2013).
  31. Rothbart, S. B., Dickson, B. M., et al. Multivalent histone engagement by the linked tandem Tudor and PHD domains of UHRF1 is required for the epigenetic inheritance of DNA methylation. Genes Dev. 27 (11), 1288-1298 (2013).
  32. Ali, M., Rincón-Arano, H., et al. Molecular basis for chromatin binding and regulation of MLL5. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (28), 11296-11301 (2013).
  33. Kinkelin, K., Wozniak, G. G., Rothbart, S. B., Lidschreiber, M., Strahl, B. D., Cramer, P. Structures of RNA polymerase II complexes with Bye1, a chromatin-binding PHF3/DIDO homologue. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (38), 15277-15282 (2013).
  34. Klein, B. J., Piao, L., et al. The histone-H3K4-specific demethylase KDM5B binds to its substrate and product through distinct PHD fingers. Cell Rep. 6 (2), 325-335 (2014).
  35. Kim, H. -. S., Mukhopadhyay, R., et al. Identification of a BET family bromodomain/casein kinase II/TAF-containing complex as a regulator of mitotic condensin function. Cell Rep. 6 (5), 892-905 (2014).
  36. Greer, E. L., Beese-Sims, S. E., et al. A histone methylation network regulates transgenerational epigenetic memory in C. elegans. Cell Rep. 7 (1), 113-126 (2014).
  37. Andrews, F. H., Tong, Q., et al. Multivalent Chromatin Engagement and Inter-domain Crosstalk Regulate MORC3 ATPase. Cell Rep. 16 (12), 3195-3207 (2016).
  38. Sidoli, S., Lin, S., Karch, K. R., Garcia, B. A. Bottom-Up and Middle-Down Proteomics Have Comparable Accuracies in Defining Histone Post-Translational Modification Relative Abundance and Stoichiometry. Anal Chem. 87 (6), 3129-3133 (2015).
  39. Tsukada, Y., Ishitani, T., Nakayama, K. I. KDM7 is a dual demethylase for histone H3 Lys 9 and Lys 27 and functions in brain development. Genes Dev. 24 (5), 432-437 (2010).
  40. Tachibana, M., Sugimoto, K., Fukushima, T., Shinkai, Y. Set domain-containing protein, G9a, is a novel lysine-preferring mammalian histone methyltransferase with hyperactivity and specific selectivity to lysines 9 and 27 of histone H3. J Biol Chem. 276 (27), 25309-25317 (2001).
  41. Wu, H., Chen, X., et al. Histone methyltransferase G9a contributes to H3K27 methylation in vivo. Cell Res. 21 (2), 365-367 (2011).
  42. Koch, C. M., Andrews, R. M., et al. The landscape of histone modifications across 1% of the human genome in five human cell lines. Genome Res. 17 (6), 691-707 (2007).
  43. Okitsu, C. Y., Hsieh, J. C. F., Hsieh, C. -. L. Transcriptional Activity Affects the H3K4me3 Level and Distribution in the Coding Region. Mol Cell Biol. 30 (12), 2933-2946 (2010).
  44. Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Res. 21 (8), 1273-1283 (2011).
  45. Garske, A. L., Oliver, S. S., et al. Combinatorial profiling of chromatin binding modules reveals multisite discrimination. Nat Chem Biol. 6 (4), 283-290 (2010).
  46. Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
  47. Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 518 (7537), 27-29 (2015).
  48. Nguyen, U. T. T., Bittova, L., et al. Accelerated chromatin biochemistry using DNA-barcoded nucleosome libraries. Nat Methods. 11 (8), 834-840 (2014).
  49. Frank, R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).
  50. Hilpert, K., Winkler, D. F. H., Hancock, R. E. W. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat Protoc. 2 (6), 1333-1349 (2007).
  51. Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity analysis of protein lysine methyltransferases using SPOT peptide arrays. J Vis Exp. (93), e52203 (2014).

Tags

Histone AntibodyPeptide MicroarrayPost-translational ModificationChromatin BiochemistryAntibody SpecificityArray NinjaMicroarray DesignMicroarray PrintingFeature IdentificationSource Plate MapProtein Microarray Printing BufferFluorescein-labeled BiotinMicroarray Printing Software
check_url/kr/55912?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Cornett, E. M., Dickson, B. M., Rothbart, S. B. Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays. J. Vis. Exp. (126), e55912, doi:10.3791/55912 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image