Analisi della specificità degli anticorpi istonici con microarray di peptide
Summary
Questo manoscritto descrive i metodi per applicare la tecnologia del microarray peptide alla profilazione di specificità degli anticorpi che riconoscono gli istoni e le loro modificazioni post-traslazionali.
Abstract
Le modificazioni post-traduzionali (PTMs) sulle proteine dell'istone sono ampiamente studiate per i loro ruoli nella regolazione della struttura cromatica e dell'espressione genica. La produzione di massa e la distribuzione di anticorpi specifici ai PTM istonici ha facilitato notevolmente la ricerca su questi segni. Poiché gli anticorpi PTM dell'istone sono reagenti chiave per molte applicazioni di biochimica cromatica, è necessaria un'analisi rigorosa della specificità degli anticorpi per un'accurata interpretazione dei dati e un progresso continuo nel campo. Questo protocollo descrive una pipeline integrata per la progettazione, la fabbricazione e l'uso di microarray peptidi per la profilazione della specificità degli anticorpi istoni. Gli aspetti di progettazione e analisi di questa procedura sono facilitati da ArrayNinja, un pacchetto software open source e interattivo che abbiamo recentemente sviluppato per semplificare la personalizzazione dei formati di stampa con microarray. Questa pipeline è stata utilizzata per la visualizzazione di un gran numero di anticorpi anti-PTM di istone commercialmente disponibili e ampiamente utilizzatiE i dati generati da questi esperimenti sono liberamente disponibili tramite un database di specificità anticorpo istante in linea e in espansione. Al di là degli istoni, la metodologia generale descritta qui può essere applicata ampiamente all'analisi degli anticorpi PTM-specifici.
Introduction
Il DNA genomico è imballato elegantemente all'interno del nucleo delle cellule eucariotiche con proteine dell'istone per formare la cromatina. La subunità ripetizione della cromatina è il nucleosoma, che consiste di 147 coppie di basi di DNA avvolto attorno ad un nucleo octameric di proteine istoni H2A, – H2B, H3, H4 e 1. La cromatinica è ampiamente organizzata in euchromatin pienamente ricoperti e domini eterocromatina strettamente confezionati. Il grado di compattazione della cromatina regola la misura in cui i macchinari di proteine possono accedere al DNA sottostante per eseguire processi fondamentali del DNA come la replica, la trascrizione e la riparazione.
I regolatori chiave dell'accessibilità del genoma nel contesto della cromatina sono PTM sui nodi non strutturati e nuclei delle proteine istone 2 , 3 . Histon PTMs funziona direttamente influenzando la struttura della cromatina 4 e indirettamenteH l'assunzione di proteine di lettura e dei loro complessi macromolecolari associati con attività di ricostruzione cromatica, enzimatica e di ponteggi 5 . Studi sulla funzione istone PTM negli ultimi due decenni suggeriscono in maniera massiccia che questi segni svolgono ruoli chiave nel regolare il destino cellulare, lo sviluppo organico e l'iniziazione / progressione delle malattie. Alimentata dai progressi della tecnologia proteomica basata sulla spettrometria di massa, sono stati scoperti più di 20 PTM istonici unici su più di 80 residui istoniali distinti 6 . Notevolmente, queste modifiche spesso si verificano in combinazioni e coerenti con l'ipotesi del codice istone, numerosi studi suggeriscono che le proteine del lettore sono destinate a regioni discrete di cromatina attraverso il riconoscimento di combinazioni specifiche di istone PTMs 7 , 8 , 9 . Una sfida fondamentale in avanti sarà attribuire funzioni al grGrazie alla lista degli istoni PTMs e per determinare come combinazioni specifiche di PTM istoni orchestrino le funzioni dinamiche associate alla cromatina.
Gli anticorpi sono i reagenti lynchpin per la rilevazione di PTM istonico. In quanto tale, più di 1.000 anticorpi specifici PTM-istone sono stati commercialmente sviluppati per l'uso nella ricerca biochimica cromatina. Con il rapido sviluppo di high-throughput tecnologia di sequenziamento del DNA, questi reagenti sono stati ampiamente utilizzati dai singoli ricercatori e epigenomics grandi "calendario" iniziative (ad esempio, codificare e progetto), in ChIP-seq (cromatina immunoprecipitazione accoppiato con sequenziamento di prossima generazione ) Per generare mappe spaziali ad alta risoluzione della distribuzione istone PTM a livello genomico 10 , 11 . Tuttavia, recenti studi hanno dimostrato che la specificità degli anticorpi PTM dell'istone può essere altamente variabile e che questi reagenti presentano Proprietà avorabili come il riconoscimento epitopico fuori bersaglio, forte influenza positiva e negativa da parte dei PTM vicini e difficoltà a discriminare l'ordine di modifica su un determinato residuo ( ad esempio mono-, di- o tri-metililossina) 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Pertanto, è necessario un controllo rigoroso della qualità dei reagenti anticorpo specifico PTM-istone per interpretare con precisione i dati generati con questi reagenti preziosi.
La tecnologia Microarray consente di interrogare simultaneamente migliaia di interazioni macromolecolari in un formato ad alta produttività, riproducibile e miniaturizzato. Per questo motivo, sono state create diverse piattaforme di microarray per analizzare il DNA proteico 19 ,"> 20, proteine-proteine 21 e proteine-peptide interazioni 22. In effetti, i microarray di peptide dell'istone sono emerse come una piattaforma di scoperta informativa per la ricerca di biochimica cromatica, consentendo una profilazione ad alta velocità degli scrittori, cancellatori e lettori di istone PTMs 15 , 23 , 24 e anche per l'analisi della specificità degli anticorpi degli istoni 17 , 25. Oltre alla loro applicazione nella ricerca di cromatina e epigenetica, gli array di peptone istonico hanno potenziale utilità come test diagnostico / prognostico per il lupus eritematoso sistemico e altre malattie autoimmuni, Gli anticorpi cromatici vengono generati 26 , 27 .
Qui descriviamo una pipeline integrata che abbiamo sviluppato per la progettazione, la fabbricazione e la queMicroarrays di peptide istone per generare profili di specificità per gli anticorpi che riconoscono gli istoni e le loro PTM. Il gasdotto è facilitata da ArrayNinja, un open-source, un'applicazione software interattivo che abbiamo recentemente sviluppato, che integra le fasi di progettazione e di analisi di esperimenti di microarray 28. ArrayNinja funziona meglio in Google Chrome. In breve, viene utilizzata una stampante microarray a contatto robotizzato per depositare una biblioteca di peptidi istoni coniugati biotina in posizioni definite su vetrini a microscopio vetrato con streptavidina. Le matrici possono quindi essere utilizzate in un modo conciso e in parallelo di test per interrogare le interazioni con gli anticorpi-epitopi ( Figura 1 ). La biblioteca del peptide è costituita da centinaia di peptidi sintetici unici che ospitano PTM (acetilazione lisina, metilazione lisina / arginina e fosforilazione serina / treonina) da soli e in combinazioni pertinenti in gran parte derivate da set di dati proteomici. Metodi per la sintesi e la convalida dei peptidi Sono dettagliate altrove 23 . I dati generati dagli sforzi di screening degli anticorpi PTH istantanei in corso utilizzando questa piattaforma di array sono archiviati in una risorsa web pubblica, il database di specificità degli anticorpi Histone (www.histoneantibodies.com). In particolare, i microarray di peptide istone fabbricati con variazioni di questo protocollo sono stati ampiamente utilizzati per caratterizzare l'attività dei domini di lettore di istone PTM 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 e più recentemente all'istone del profilo PTM scrittore e attività gomma 24 .
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Figura 1: Disposizione del fumetto della procedura stepwise per la screening degli anticorpi su un microarray di peptide dell'istone. I peptidi biotinilati di istone che ospitano modifiche post-traslazionali definite (cerchi rossi e blu) sono stampati con biotina-fluoresceina sul vetro rivestito con streptavidina. Le interazioni positive sono visualizzate come fluorescenza rossa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'affidabilità degli anticorpi nelle applicazioni di ricerca biomedica è fondamentale 46 , 47 . Ciò è particolarmente vero nella biochimica cromatica data la posizione degli anticorpi come strumenti chiave per la maggior parte delle tecniche sviluppate per caratterizzare l'abbondanza e la distribuzione di PTM istoniche. Il protocollo qui presentato illustra una pipeline ottimizzata per la progettazione, la fabbricazione e l'uso di microarray pept…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da Van Andel Research Institute e da una borsa di studio degli Istituti Nazionali di Sanità (CA181343) a SBR
Materials
| Printing Buffer | ArrayIt | PPB | |
| BSA | Omnipure | 2390 | |
| Streptavidin-coated glass microscope slides | Greiner Bio-one | 439003-25 | |
| polypropylene 384 well plate | Greiner Bio-one | 784201 | |
| Biotin-fluorescein | Sigma | 53608 | |
| contact microarray printer | Aushon | 2470 | Aushon 2470 Microarray Printer |
| contact microarray printer | Gene Machines | OmniGrid 100 | OmniGrid Microarray Printer |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Blocking Buffer | ArrayIt | SBB | |
| Hydrophobic wax pen | Vector Labs | H-4000 | ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen |
| Silicon Gasket | Grace Bio-labs | 622511 | |
| Hybridization Vessel | Thermo Scientific | 267061 | or similar vessel |
| Fluorescent-dye conjugated secondary antibody | Life Technologies | A-21244 | Alexa Fluor 647 (anti-rabbit) |
| Fluorescent-dye conjugated secondary antibody | Life Technologies | A-21235 | Alexa Fluor 647 (anti-mouse) |
| Wax Imprinter | ArrayIt | MSI48 | |
| Tween-20 | Omnipure | 9490 | |
| Microarray Scanner | Innopsys | InnoScan 1100AL | or equivalent microarray scanner |
| EipTitan Histone Peptide Microarray | Epicypher | 112001 | |
| AbSurance Pro Histone Peptide Microarray | Millipore | 16668 | |
| MODified Histone Peptide Array | Active Motif | 13001 | |
| Histone Code Peptide Microarrays | JPT | His_MA_01 | |
| Wax | Royal Oak | GulfWax | for wax imprinter |
| Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber | VWR | 97000-284 | |
| High throughput microscope slide washing chamber | ArrayIt | HTW | |
| Microscope slide centrifuge | VWR | 93000-204 | |
| Antibody 1 | Abcam | 8898 | |
| Antibody 2 | Millipore | 07-473 | |
| Biotinylated histone peptide | EpiCypher | 12-0001 | Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources. |
| ImageMagick | https://www.imagemagick.org/script/index.php | ||
| ArrayNinja | https://rothbartlab.vai.org/tools/ |
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