JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
생화학

Analyse av histonantistof spesifisitet med peptidmikroarrays

Published: August 01, 2017
doi:
10.3791/55912
, ,
1Center for Epigenetics,Van Andel Research Institute

Summary

Dette manuskriptet beskriver metoder for anvendelse av peptidmikroarray-teknologi til spesifisitetsprofilering av antistoffer som gjenkjenner histoner og deres posttranslasjonelle modifikasjoner.

Abstract

Post-translasjonelle modifikasjoner (PTMs) på histonproteiner studeres mye for deres roller i regulering av kromatinstruktur og genuttrykk. Masseproduksjonen og fordelingen av antistoffer som er spesifikke for histon-PTM, har i stor grad tilrettelagt for forskning på disse merkene. Siden histon-PTM-antistoffer er nøkkelreagenser for mange kromatinbiokemiske applikasjoner, er streng analyse av antistoff-spesifisitet nødvendig for nøyaktig dataintolking og fortsatt fremgang i feltet. Denne protokollen beskriver en integrert rørledning for utforming, fabrikasjon og bruk av peptidmikroarrays for profiling av spesifisitet av histon-antistoffer. Design og analyse aspekter av denne prosedyren er lettet av ArrayNinja, en åpen kildekode og interaktiv programvarepakke vi nylig utviklet for å effektivisere tilpasningen av microarray utskriftsformater. Denne rørledningen har blitt brukt til å skjerme et stort antall kommersielt tilgjengelig og mye brukt histone PTM antibodiesS, og data generert fra disse forsøkene er fritt tilgjengelige gjennom en online og ekspanderende Histone Antibody Specificity Database. Utover histoner kan den generelle metode som beskrives her, anvendes bredt til analysen av PTM-spesifikke antistoffer.

Introduction

Genomisk DNA pakkes elegant inn i eukaryotisk cellekjerne med histonproteiner for å danne kromatin. Den gjentatte underenheten av kromatin er nukleosomet, som består av 147 basepar DNA som er pakket rundt en oktamerisk kjerne av histonproteiner – H2A, H2B, H3 og H4 1 . Kromatin er bredt organisert i løst pakket eukromatin og tett pakket heterochromatin domener. Graden av kromatin-komprimering regulerer i hvilken grad proteinindustrien kan få tilgang til det underliggende DNA for å gjennomføre grunnleggende DNA-templerte prosesser som replikering, transkripsjon og reparasjon.

Nøkkelregulatorer for genometilgjengelighet i forbindelse med kromatin er PTM på de ustrukturerte hale- og kjerneområdene av histonproteiner 2 , 3 . Histone PTMs fungerer direkte ved å påvirke strukturen av kromatin 4 og indirekte gjennomgåendeH rekruttering av leserproteiner og deres tilhørende makromolekylære komplekser som har kromatin remodeling, enzymatisk og stillas aktiviteter 5 . Studier av histone PTM-funksjon de siste to tiårene tyder overveldende på at disse merkene spiller nøkkelrolle i regulering av cellefell, organisasjonsutvikling og sykdomsinitiering / progresjon. Fueled av fremskritt i massespektrometribasert proteomteknologi, er det funnet mer enn 20 unike histon-PTM på mer enn 80 forskjellige histonrester 6 . Spesielt forekommer disse endringene ofte i kombinasjoner, og i samsvar med "histonkoden" -hypotesen, viser mange studier at leserproteiner er målrettet mot diskrete kromatinegrupper gjennom anerkjennelse av spesifikke kombinasjoner av histon PTMs 7 , 8 , 9 . En viktig utfordring fremover vil være å tilordne funksjoner til grPå grunn av listen over histon PTMer og å bestemme hvordan bestemte kombinasjoner av histon PTMer orkestrerer de dynamiske funksjonene assosiert med kromatin.

Antistoffer er lynchpinreagensene for påvisning av histon PTM. Som sådan har mer enn 1000 histon-PTM-spesifikke antistoffer blitt kommersielt utviklet for bruk i kromatisk biokjemiforskning. Med den raske utviklingen av DNA-sekvenseringsteknologi med høy gjennomstrømning, brukes disse reagensene i stor grad av individuelle etterforskere og omfattende epigenomiske "veikart" -initiativer ( f.eks . ENCODE og BLUEPRINT) i ChIP-seq (kromatinimmunutfelling kombinert med neste generasjons sekvensering ) Rørledninger for å generere geografiske kart med høy oppløsning av histon PTM-fordelingsgenom-bred 10 , 11 . Nylige studier har imidlertid vist at spesifisiteten av histon-PTM-antistoffer kan være svært variabel og at disse reagensene viser uferdige Dårlige egenskaper som ikke-mål epitopgjenkjenning, sterk positiv og negativ påvirkning av nabo-PTM, og vanskeligheter med å diskriminere modifikasjonsordren på en bestemt rest ( f.eks . Mono-, di- eller tri-metyllysin) 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Derfor er streng kvalitetskontroll av histon PTM-spesifikke antistoffreagenser nødvendig for å nøyaktig tolke data generert med disse verdifulle reagensene.

Microarray-teknologi gjør det mulig for simultant forhør av tusenvis av makromolekylære interaksjoner i et gjennomgående, reproduserbart og miniatyrisert format. Av denne grunn har en rekke mikroarrayplattformer blitt opprettet for å analysere protein-DNA 19 ,"> 20, protein-protein 21 og protein-peptid-interaksjoner 22. Faktisk har histonpeptidmikroarrays oppstått som en informativ funningsplattform for kromatinbiokjemiforskning, som muliggjør høy gjennomstrømmingsprofilering av forfattere, viskelærer og lesere av histon PTM 15 , 23, 24, og også for analyse av histon-antistoffspesifisitet 17, 25. Utover deres anvendelse i kromatin og epigenetikk forskning, histon peptid-matriser har potensiell anvendelse som et diagnostisk / prognostisk test for systemisk lupus erythematosus og andre autoimmune sykdommer hvor anti- Kromatin-autoantistoffer blir dannet 26 , 27 .

Her beskriver vi en integrert rørledning som vi har utviklet for å designe, fabrikere og kjøreRydder histonpeptidmikroarrays for å generere spesifisitetsprofiler for antistoffer som gjenkjenner histon og deres PTM. Rørledningen forenkles av ArrayNinja, et interaktivt program for åpen kildekode som vi nylig utviklet, som integrerer design- og analysestadene i mikroarray-eksperimenter 28 . ArrayNinja fungerer best i Google Chrome. Kort fortalt brukes en mikrokrysserskriver med robotkontakt til å deponere et bibliotek med biotinkonjugerte histonpeptider i definerte posisjoner på streptavidin-belagte glassmikroskopriller. Arrays kan da brukes i et konkurransedyktig og parallelt analyseringsformat for å forhøre antistoff-epitop-interaksjoner ( figur 1 ). Peptidbiblioteket består av hundrevis av unike syntetiske peptider som inneholder PTM (lysinacetylering, lysin / argininmetylering og serin / treoninfosforylering) alene og i relevante kombinasjoner i stor grad avledet fra proteomiske datasett. Metoder for peptidsyntese og validering Er detaljert andre steder 23 . Data generert fra vår pågående histone PTM antistoff screening innsats utnytte denne array plattformen er arkivert på en offentlig web ressurs, Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com). Spesielt er histonpeptidmikroarrays fremstilt med variasjoner av denne protokollen blitt brukt i stor utstrekning for å karakterisere aktiviteten til histone PTM-leserdomene 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 og mer nylig for å profilere histon PTM forfatter og viskelærer 24 .

/files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg "/>
Figur 1: Tegneserievisning av trinnvis prosedyre for antistoff-screening på en histonpeptid-mikroarray. Biotinylerte histonpeptider som inneholder definerte posttranslasjonelle modifikasjoner (røde og blå sirkler) er medtrykt med biotin-fluorescein på streptavidinbelagt glass. Positive interaksjoner visualiseres som rød fluorescens. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

1. Installere og kjøre ArrayNinja Last ned og installer Oracle Virtual Box fra www.virtualbox.org. Last ned og komprimer ArrayNinja virtuell maskin (VM) fra http://research.vai.org/Tools/arrayninja. Åpne Virtual Box og legg til ArrayNinja VM ved å klikke 'Maskin', 'Legg til', og velg arrayninja.vbox fra mappen der ArrayNinja VM ble lagret. Start ArrayNinja ved å velge den i Virtual Box og klikk på den grønne "start" -pilen. Virtual Box å…

Representative Results

Denne protokollen har blitt brukt til å designe og fremstille en peptidmikroarrayplattform for analyse av histon PTM antistoff-spesifisitet. Oppstillingen spør etter et bibliotek med mer enn 300 unike peptidfunksjoner (20 – 40 rester i lengden) som representerer mange av de kjente kombinasjonene av PTM som finnes på kjerne- og varianthistonproteiner 38 . Denne rørledningen har vært en arbeidshest for screening av mange brukte og kommersielt tilgjengelige hist…

Discussion

Antistoffets pålitelighet i biomedisinske søknader er viktigst 46 , 47 . Dette gjelder spesielt i kromatinbiokjemi gitt antistoffposisjon som nøkkelverktøy for flertallet av teknikker utviklet for å karakterisere overflaten og fordelingen av histon PTM. Protokollen presenterte her detaljer en optimalisert rørledning for utforming, fabrikasjon og bruk av peptidmikroarrays for å analysere histon PTM antistoff spesifisitet. Denne rørledningen har blitt bruk…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble delvis støttet av Van Andel Research Institute og et forskningsbidrag fra National Institutes of Health (CA181343) til SBR

Materials

Printing Buffer ArrayIt PPB
BSA Omnipure 2390
Streptavidin-coated glass microscope slides Greiner Bio-one 439003-25
polypropylene 384 well plate Greiner Bio-one 784201
Biotin-fluorescein Sigma 53608
contact microarray printer Aushon 2470 Aushon 2470 Microarray Printer
contact microarray printer Gene Machines OmniGrid 100 OmniGrid Microarray Printer
PBS Invitrogen 14190
Blocking Buffer ArrayIt SBB
Hydrophobic wax pen Vector Labs H-4000 ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen
Silicon Gasket Grace Bio-labs 622511
Hybridization Vessel Thermo Scientific 267061 or similar vessel
Fluorescent-dye conjugated secondary antibody Life Technologies A-21244 Alexa Fluor 647 (anti-rabbit)
Fluorescent-dye conjugated secondary antibody Life Technologies A-21235 Alexa Fluor 647 (anti-mouse)
Wax Imprinter ArrayIt MSI48
Tween-20 Omnipure 9490
Microarray Scanner Innopsys InnoScan 1100AL or equivalent microarray scanner
EipTitan Histone Peptide Microarray Epicypher 112001
AbSurance Pro Histone Peptide Microarray Millipore 16668
MODified Histone Peptide Array Active Motif 13001
Histone Code Peptide Microarrays JPT His_MA_01
Wax Royal Oak GulfWax for wax imprinter
Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber VWR 97000-284
High throughput microscope slide washing chamber ArrayIt HTW
Microscope slide centrifuge VWR 93000-204
Antibody 1 Abcam 8898
Antibody 2 Millipore 07-473
Biotinylated histone peptide EpiCypher 12-0001 Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources.
ImageMagick https://www.imagemagick.org/script/index.php
ArrayNinja https://rothbartlab.vai.org/tools/
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Steensel, B. Chromatin: constructing the big picture. EMBO J. 30 (10), 1885-1895 (2011).
  2. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  3. Rothbart, S. B., Strahl, B. D. Interpreting the language of histone and DNA modifications. Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 627-643 (2014).
  4. Shogren-Knaak, M., Ishii, H., Sun, J. -. M., Pazin, M. J., Davie, J. R., Peterson, C. L. Histone H4-K16 acetylation controls chromatin structure and protein interactions. Science. 311 (5762), 844-847 (2006).
  5. Musselman, C. A., Lalonde, M. -. E., Côté, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
  6. Huang, H., Sabari, B. R., Garcia, B. A., Allis, C. D., Zhao, Y. SnapShot: Histone Modifications. Cell. 159 (2), 458 (2014).
  7. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  8. Rothbart, S. B., Krajewski, K., et al. Association of UHRF1 with methylated H3K9 directs the maintenance of DNA methylation. Nat Struct Mol Biol. 19 (11), 1155-1160 (2012).
  9. Wang, Z., Zang, C., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nat Genet. 40 (7), 897-903 (2008).
  10. Stunnenberg, H. G., Hirst, M. The International Human Epigenome Consortium: A Blueprint for Scientific Collaboration and Discovery. Cell. 167 (5), 1145-1149 (2016).
  11. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  12. Egelhofer, T. A., Minoda, A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
  13. Bock, I., Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Brandt, O., Rathert, P., Jeltsch, A. Detailed specificity analysis of antibodies binding to modified histone tails with peptide arrays. Epigenetics. 6 (2), 256-263 (2011).
  14. Busby, M., Xue, C., et al. Systematic comparison of monoclonal versus polyclonal antibodies for mapping histone modifications by ChIP-seq. Epigenetics Chromatin. 9, 49 (2016).
  15. Fuchs, S. M., Krajewski, K., Baker, R. W., Miller, V. L., Strahl, B. D. Influence of combinatorial histone modifications on antibody and effector protein recognition. Curr Biol. 21 (1), 53-58 (2011).
  16. Kungulovski, G., Jeltsch, A. Quality of histone modification antibodies undermines chromatin biology research. F1000Research. 4, 1160 (2015).
  17. Rothbart, S. B., Dickson, B. M., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
  18. Rothbart, S. B., Lin, S., et al. Poly-acetylated chromatin signatures are preferred epitopes for site-specific histone H4 acetyl antibodies. Sci Rep. 2, 489 (2012).
  19. Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nat Protoc. 4 (3), 393-411 (2009).
  20. Hu, S., Wan, J., et al. DNA methylation presents distinct binding sites for human transcription factors. eLife. 2, e00726 (2013).
  21. Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. Applications in high-content functional protein microarrays. Curr Opin Chem Biol. 30, 21-27 (2016).
  22. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289 (5485), 1760-1763 (2000).
  23. Rothbart, S. B., Krajewski, K., Strahl, B. D., Fuchs, S. M. Peptide microarrays to interrogate the “histone code” . Methods Enzymol. 512, 107-135 (2012).
  24. Cornett, E. M., Dickson, B. M., et al. Substrate Specificity Profiling of Histone-Modifying Enzymes by Peptide Microarray. Methods Enzymol. 574, 31-52 (2016).
  25. Nady, N., Min, J., Kareta, M. S., Chédin, F., Arrowsmith, C. H. A SPOT on the chromatin landscape? Histone peptide arrays as a tool for epigenetic research. Trends Biochem Sci. 33 (7), 305-313 (2008).
  26. Dieker, J., Berden, J. H., et al. Autoantibodies against Modified Histone Peptides in SLE Patients Are Associated with Disease Activity and Lupus Nephritis. PLoS ONE. 11 (10), (2016).
  27. Price, J. V., Tangsombatvisit, S., et al. “On silico” peptide microarrays for high-resolution mapping of antibody epitopes and diverse protein-protein interactions. Nat Med. 18 (9), 1434-1440 (2012).
  28. Dickson, B. M., Cornett, E. M., Ramjan, Z., Rothbart, S. B. ArrayNinja: An Open Source Platform for Unified Planning and Analysis of Microarray Experiments. Methods Enzymol. 574, 53-77 (2016).
  29. Gatchalian, J., Fütterer, A., et al. Dido3 PHD modulates cell differentiation and division. Cell Rep. 4 (1), 148-158 (2013).
  30. Cai, L., Rothbart, S. B., et al. An H3K36 methylation-engaging Tudor motif of polycomb-like proteins mediates PRC2 complex targeting. Mol Cell. 49 (3), 571-582 (2013).
  31. Rothbart, S. B., Dickson, B. M., et al. Multivalent histone engagement by the linked tandem Tudor and PHD domains of UHRF1 is required for the epigenetic inheritance of DNA methylation. Genes Dev. 27 (11), 1288-1298 (2013).
  32. Ali, M., Rincón-Arano, H., et al. Molecular basis for chromatin binding and regulation of MLL5. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (28), 11296-11301 (2013).
  33. Kinkelin, K., Wozniak, G. G., Rothbart, S. B., Lidschreiber, M., Strahl, B. D., Cramer, P. Structures of RNA polymerase II complexes with Bye1, a chromatin-binding PHF3/DIDO homologue. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (38), 15277-15282 (2013).
  34. Klein, B. J., Piao, L., et al. The histone-H3K4-specific demethylase KDM5B binds to its substrate and product through distinct PHD fingers. Cell Rep. 6 (2), 325-335 (2014).
  35. Kim, H. -. S., Mukhopadhyay, R., et al. Identification of a BET family bromodomain/casein kinase II/TAF-containing complex as a regulator of mitotic condensin function. Cell Rep. 6 (5), 892-905 (2014).
  36. Greer, E. L., Beese-Sims, S. E., et al. A histone methylation network regulates transgenerational epigenetic memory in C. elegans. Cell Rep. 7 (1), 113-126 (2014).
  37. Andrews, F. H., Tong, Q., et al. Multivalent Chromatin Engagement and Inter-domain Crosstalk Regulate MORC3 ATPase. Cell Rep. 16 (12), 3195-3207 (2016).
  38. Sidoli, S., Lin, S., Karch, K. R., Garcia, B. A. Bottom-Up and Middle-Down Proteomics Have Comparable Accuracies in Defining Histone Post-Translational Modification Relative Abundance and Stoichiometry. Anal Chem. 87 (6), 3129-3133 (2015).
  39. Tsukada, Y., Ishitani, T., Nakayama, K. I. KDM7 is a dual demethylase for histone H3 Lys 9 and Lys 27 and functions in brain development. Genes Dev. 24 (5), 432-437 (2010).
  40. Tachibana, M., Sugimoto, K., Fukushima, T., Shinkai, Y. Set domain-containing protein, G9a, is a novel lysine-preferring mammalian histone methyltransferase with hyperactivity and specific selectivity to lysines 9 and 27 of histone H3. J Biol Chem. 276 (27), 25309-25317 (2001).
  41. Wu, H., Chen, X., et al. Histone methyltransferase G9a contributes to H3K27 methylation in vivo. Cell Res. 21 (2), 365-367 (2011).
  42. Koch, C. M., Andrews, R. M., et al. The landscape of histone modifications across 1% of the human genome in five human cell lines. Genome Res. 17 (6), 691-707 (2007).
  43. Okitsu, C. Y., Hsieh, J. C. F., Hsieh, C. -. L. Transcriptional Activity Affects the H3K4me3 Level and Distribution in the Coding Region. Mol Cell Biol. 30 (12), 2933-2946 (2010).
  44. Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Res. 21 (8), 1273-1283 (2011).
  45. Garske, A. L., Oliver, S. S., et al. Combinatorial profiling of chromatin binding modules reveals multisite discrimination. Nat Chem Biol. 6 (4), 283-290 (2010).
  46. Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
  47. Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 518 (7537), 27-29 (2015).
  48. Nguyen, U. T. T., Bittova, L., et al. Accelerated chromatin biochemistry using DNA-barcoded nucleosome libraries. Nat Methods. 11 (8), 834-840 (2014).
  49. Frank, R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).
  50. Hilpert, K., Winkler, D. F. H., Hancock, R. E. W. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat Protoc. 2 (6), 1333-1349 (2007).
  51. Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity analysis of protein lysine methyltransferases using SPOT peptide arrays. J Vis Exp. (93), e52203 (2014).

Tags

Histone AntibodyPeptide MicroarrayPost-translational ModificationChromatin BiochemistryAntibody SpecificityArray NinjaMicroarray DesignMicroarray PrintingFeature IdentificationSource Plate MapProtein Microarray Printing BufferFluorescein-labeled BiotinMicroarray Printing Software

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Cornett, E. M., Dickson, B. M., Rothbart, S. B. Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays. J. Vis. Exp. (126), e55912, doi:10.3791/55912 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image