Análisis de especificidad de anticuerpos histona con microarrays peptídicos
Summary
Este manuscrito describe métodos para aplicar la tecnología de microarrays de péptidos a la especificidad de perfiles de anticuerpos que reconocen las histonas y sus modificaciones post-traduccionales.
Abstract
Las modificaciones postraduccionales (PTMs) en las proteínas histonas son ampliamente estudiadas por sus papeles en la regulación de la estructura de la cromatina y la expresión génica. La producción en masa y la distribución de anticuerpos específicos de histonas PTMs ha facilitado enormemente la investigación sobre estas marcas. Como los anticuerpos histónicos PTM son reactivos clave para muchas aplicaciones de bioquímica de la cromatina, es necesario un análisis riguroso de la especificidad del anticuerpo para una interpretación precisa de los datos y un progreso continuo en el campo. Este protocolo describe una tubería integrada para el diseño, fabricación y uso de microarrays peptídicos para perfilar la especificidad de los anticuerpos histona. Los aspectos de diseño y análisis de este procedimiento son facilitados por ArrayNinja, un paquete de software interactivo y de código abierto que recientemente desarrollamos para simplificar la personalización de los formatos de impresión en microarrays. Este gasoducto se ha utilizado para examinar un gran número de anticonceptivos de histonas PTM comercialmente disponibles y ampliamente utilizadosS, y los datos generados a partir de estos experimentos están disponibles gratuitamente a través de una base de datos en línea y en expansión Histone Antibody Specificity. Más allá de las histonas, la metodología general aquí descrita puede aplicarse ampliamente al análisis de anticuerpos específicos de PTM.
Introduction
El ADN genómico se empaqueta elegantemente dentro del núcleo de la célula eucariota con proteínas histonas para formar cromatina. La subunidad de repetición de la cromatina es el nucleosoma, que consiste en 147 pares de bases de ADN envueltas alrededor de un núcleo octameric de las proteínas histonas – H2A, H2B, H3 y H4 1 . La cromatina se organiza ampliamente en euchromatina libremente envasada y dominios de heterocromatina fuertemente envasados. El grado de compactación de la cromatina regula la medida en que las máquinas de proteínas pueden acceder al ADN subyacente para llevar a cabo procesos fundamentales basados en el ADN, como la replicación, la transcripción y la reparación.
Los reguladores clave de la accesibilidad del genoma en el contexto de la cromatina son PTMs en la cola no estructurada y los dominios centrales de las proteínas histonas 2 , 3 . Las PTM histonas funcionan directamente influyendo en la estructura de la cromatina 4 e indirectamenteH la contratación de proteínas lectoras y sus complejos macromoleculares asociados que tienen actividades de remodelación, enzimática y andamiaje de la cromatina 5 . Los estudios de la función PTM de las histonas durante las últimas dos décadas sugieren abrumadoramente que estas marcas juegan un papel clave en la regulación del destino celular, el desarrollo de organismos y la iniciación / progresión de la enfermedad. Impulsados por los avances en espectrometría de masas basado en la tecnología proteómica, más de 20 único histone PTMs en más de 80 residuos distintos de histonas se han descubierto [ 6] . En particular, estas modificaciones a menudo se producen en combinaciones, y en consonancia con la hipótesis de "código de histonas", numerosos estudios sugieren que las proteínas lectoras son dirigidas a regiones discretas de cromatina a través del reconocimiento de combinaciones específicas de histonas PTMs 7 , 8 , 9 . Un desafío clave para avanzar será la asignación de funciones al grDebido a la lista de histonas PTMs y para determinar cómo específicas combinaciones de histonas PTMs orquestar las funciones dinámicas asociadas con la cromatina.
Los anticuerpos son los reactivos de la linterna para la detección de PTM histonas. Como tal, más de 1.000 histonas PTM anticuerpos específicos han sido comercialmente desarrollado para su uso en la investigación de la bioquímica de la cromatina. Con el rápido desarrollo de la tecnología de secuenciación de ADN de alto rendimiento, estos reactivos están siendo utilizados ampliamente por investigadores individuales y iniciativas epigenómicas a gran escala ( por ejemplo , ENCODE y BLUEPRINT) en ChIP-seq (inmunoprecipitación de cromatina junto con secuenciación de próxima generación ) De tuberías para generar de alta resolución mapas espaciales de histonas PTM distribución de todo el genoma 10 , 11 . Sin embargo, estudios recientes han demostrado que la especificidad de los anticuerpos PTM de las histonas puede ser altamente variable y que estos reactivos presentan Las propiedades avorables tales como el reconocimiento de epítopos fuera de objetivo, la fuerte influencia positiva y negativa por PTMs vecinas y la dificultad para discriminar la orden de modificación en un residuo particular ( por ejemplo , mono-, di- o trimetil-lisina) 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Por lo tanto, es necesario un riguroso control de calidad de los reactivos de anticuerpos específicos de histonas PTM para interpretar con precisión los datos generados con estos valiosos reactivos.
La tecnología de microarray permite la interrogación simultánea de miles de interacciones macromoleculares en un formato de alto rendimiento, reproducible y miniaturizado. Por esta razón, una variedad de plataformas de microarrays se han creado para analizar la proteína-ADN 19 ,20, la proteína-proteína 21 , y las interacciones proteína-péptido 22. De hecho, los microarrays de péptidos histona han surgido como una plataforma de descubrimiento informativo para la investigación de la bioquímica de la cromatina, permitiendo el perfilado de alto rendimiento de los escritores, borradores y lectores de histonas PTMs 15 , 23, 24, y también para el análisis de la especificidad del anticuerpo de histona 17, 25. más allá de su aplicación en la cromatina y la epigenética investigación, las matrices de péptidos de histona tienen utilidad potencial como una prueba de diagnóstico / pronóstico para el lupus eritematoso sistémico y otras enfermedades autoinmunes donde anti- Se generan autoanticuerpos de cromatina 26 , 27 .
Aquí, describimos una tubería integrada que hemos desarrollado para diseñar, fabricar yPara generar perfiles de especificidad para anticuerpos que reconocen las histonas y sus PTMs. El pipeline es facilitado por ArrayNinja, una aplicación de código abierto de software interactivo que recientemente desarrollamos, que integra las etapas de diseño y análisis de los experimentos con microarrays [ 28] . ArrayNinja funciona mejor en Google Chrome. En resumen, se utiliza una impresora de microarrays de contacto robótico para depositar una biblioteca de péptidos de histona conjugados con biotina en posiciones definidas en portaobjetos de microscopio de vidrio revestidos con estreptavidina. Las matrices se pueden utilizar entonces en un formato de ensayo competitivo y paralelo para interrogar las interacciones anticuerpo-epítopo ( Figura 1 ). La biblioteca de péptidos consiste en cientos de péptidos sintéticos únicos que albergan PTMs (acetilación de lisina, metilación de lisina / arginina y fosforilación serina / treonina) solos y en combinaciones relevantes derivadas en gran medida de conjuntos de datos proteómicos. Métodos de síntesis y validación de péptidos Se detallan en otra parte 23 . Los datos generados a partir de nuestros esfuerzos de detección de anticuerpos PTM de histonas en curso que utilizan esta plataforma de matriz se archivan en un recurso público de la web, la Base de datos de especificidad de anticuerpos de histonas (www.histoneantibodies.com). En particular, los microarrays de péptidos de histona fabricados con variaciones de este protocolo también se han utilizado ampliamente para caracterizar la actividad de los dominios de lectores de PTM de histonas 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 y más recientemente a histona de perfil Actividades de escritor y borrador de PTM 24 .
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Figura 1: Representación de dibujos animados del procedimiento escalonado para la detección de anticuerpos en un microarray de péptidos histona. Los péptidos de histona biotinilados que albergan modificaciones postraduccionales definidas (círculos rojos y azules) se co-imprimen con biotina-fluoresceína sobre vidrio revestido con estreptavidina. Las interacciones positivas se visualizan como fluorescencia roja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
La fiabilidad de los anticuerpos en aplicaciones de investigación biomédica es fundamental 46 , 47 . Esto es especialmente cierto en la bioquímica de la cromatina dada la posición de los anticuerpos como herramientas clave para la mayoría de las técnicas desarrolladas para caracterizar la abundancia y distribución de histonas PTMs. El protocolo presentado aquí detalla un oleoducto optimizado para el diseño, fabricación y uso de microarrays de péptidos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por el Instituto de Investigación Van Andel y una beca de investigación de los Institutos Nacionales de Salud (CA181343) a SBR
Materials
| Printing Buffer | ArrayIt | PPB | |
| BSA | Omnipure | 2390 | |
| Streptavidin-coated glass microscope slides | Greiner Bio-one | 439003-25 | |
| polypropylene 384 well plate | Greiner Bio-one | 784201 | |
| Biotin-fluorescein | Sigma | 53608 | |
| contact microarray printer | Aushon | 2470 | Aushon 2470 Microarray Printer |
| contact microarray printer | Gene Machines | OmniGrid 100 | OmniGrid Microarray Printer |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Blocking Buffer | ArrayIt | SBB | |
| Hydrophobic wax pen | Vector Labs | H-4000 | ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen |
| Silicon Gasket | Grace Bio-labs | 622511 | |
| Hybridization Vessel | Thermo Scientific | 267061 | or similar vessel |
| Fluorescent-dye conjugated secondary antibody | Life Technologies | A-21244 | Alexa Fluor 647 (anti-rabbit) |
| Fluorescent-dye conjugated secondary antibody | Life Technologies | A-21235 | Alexa Fluor 647 (anti-mouse) |
| Wax Imprinter | ArrayIt | MSI48 | |
| Tween-20 | Omnipure | 9490 | |
| Microarray Scanner | Innopsys | InnoScan 1100AL | or equivalent microarray scanner |
| EipTitan Histone Peptide Microarray | Epicypher | 112001 | |
| AbSurance Pro Histone Peptide Microarray | Millipore | 16668 | |
| MODified Histone Peptide Array | Active Motif | 13001 | |
| Histone Code Peptide Microarrays | JPT | His_MA_01 | |
| Wax | Royal Oak | GulfWax | for wax imprinter |
| Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber | VWR | 97000-284 | |
| High throughput microscope slide washing chamber | ArrayIt | HTW | |
| Microscope slide centrifuge | VWR | 93000-204 | |
| Antibody 1 | Abcam | 8898 | |
| Antibody 2 | Millipore | 07-473 | |
| Biotinylated histone peptide | EpiCypher | 12-0001 | Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources. |
| ImageMagick | https://www.imagemagick.org/script/index.php | ||
| ArrayNinja | https://rothbartlab.vai.org/tools/ |
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