Analys av histonantikroppspecificitet med peptidmikroarrays
Summary
Detta manuskript beskriver metoder för tillämpning av peptidmikroarray-teknik för specificitetsprofilering av antikroppar som känner igen histoner och deras posttranslationella modifikationer.
Abstract
Post-translationella modifieringar (PTM) på histonproteiner studeras allmänt för sina roller vid reglering av kromatinstruktur och genuttryck. Massproduktionen och distributionen av antikroppar specifika för histon PTM har underlättat forskning på dessa märken. Eftersom histon-PTM-antikroppar är nyckelreagenser för många kromatinbiokemiapplikationer är rigorös analys av antikroppsspecificitet nödvändig för noggrann datatolkning och fortsatta framsteg inom området. Detta protokoll beskriver en integrerad rörledning för konstruktion, tillverkning och användning av peptidmikroarrays för profilering av specificiteten hos histonantikroppar. Design och analys aspekter av detta förfarande underlättas av ArrayNinja, ett open source och interaktivt mjukvarupaket som vi nyligen utvecklat för att effektivisera anpassningen av microarray-utskriftsformat. Denna rörledning har använts för att skärpa ett stort antal kommersiellt tillgängliga och allmänt använda histon PTM-antikropparS, och data som genereras från dessa experiment är fritt tillgängliga genom en online och expanderande Histone Antibody Specificity Database. Utöver histoner kan den allmänna metod som beskrivs häri appliceras i stor utsträckning till analysen av PTM-specifika antikroppar.
Introduction
Genomiskt DNA packas elegant inuti den eukaryota cellkärnan med histonproteiner för att bilda kromatin. Den repeterande subenheten av kromatin är nukleosomen, som består av 147 baspar av DNA lindade runt en oktamert kärna av histonproteiner – H2A, H2B, H3 och H4 1. Kromatin är brett organiserad i löst packade eukromatin och tätt packade heterochromatindomäner. Graden av kromatinkomprimering reglerar i vilken utsträckning vilka proteinmaskiner kan komma åt det underliggande DNA för att utföra grundläggande DNA-templerade processer såsom replikation, transkription och reparation.
Huvudregulatorer av genomtillgänglighet i samband med kromatin är PTM på de ostrukturerade svans- och kärndomänerna hos histonproteinerna 2 , 3 . Histon PTMs fungerar direkt genom att påverka strukturen hos kromatin 4 och indirektH rekryteringen av läseproteiner och deras associerade makromolekylära komplex som har kromatinkonstruktion, enzymatisk och ställningsaktiviteter 5 . Studier av histon PTM-funktion under de senaste två decennierna föreslår överväldigande dessa märken spelar nyckelroller för att reglera celllina, organismutveckling och sjukdomsinitiering / progression. Fueled av framsteg i masspektrometribaserad proteomteknik har mer än 20 unika histon-PTM på mer än 80 olika histonrester upptäckts 6 . I synnerhet förekommer dessa modifieringar ofta i kombinationer och i överensstämmelse med "histon-kod" -hypotesen, visar många studier att läsareproteiner är riktade mot diskreta områden av kromatin genom igenkänning av specifika kombinationer av histon PTMs 7 , 8 , 9 . En viktig utmaning framöver är att tilldela funktioner till grPå grund av en lista över histon PTM och för att bestämma hur specifika kombinationer av histon PTM orkestrerar de dynamiska funktionerna som är associerade med kromatin.
Antikroppar är lynchpinreagenserna för detektering av histon-PTM. Som sådan har mer än 1000 histon-PTM-specifika antikroppar utvecklats kommersiellt för användning vid kromatisk biokemiforskning. Med den snabba utvecklingen av DNA-sekvenseringsteknologi med hög genomströmning används dessa reagenser i stor utsträckning av enskilda utredare och storskaliga epigenomiska "roadmap" -initiativ ( t.ex. ENCODE och BLUEPRINT) i ChIP-seq (kromatinimmunutfällning kopplad till nästa generations sekvensering ) Rörledningar för att generera högupplösande rumsliga kartor över histon-PTM-fördelningsgenombrett 10 , 11 . Nya studier har dock visat att specificiteten hos histon-PTM-antikroppar kan vara mycket variabel och att dessa reagenser uppvisar oförmåga Skäliga egenskaper som off-target-epitopigenkänning, starkt positivt och negativt inflytande av närliggande PTM, och svårigheter att diskriminera modifieringsordningen på en viss rest ( t.ex. mono-, di- eller tri-metyllysin) 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Därför är en stringent kvalitetskontroll av histon PTM-specifika antikroppreagens nödvändiga för att noggrant tolka data som genereras med dessa värdefulla reagens.
Microarray-teknik möjliggör samtidig utfrågning av tusentals makromolekylära interaktioner i ett genomskinligt, reproducerbart och miniatyriserat format. Av denna anledning har en mängd olika mikroarrayplattformar skapats för att analysera protein-DNA 19 ,"> 20, proteinprotein 21 och proteinpeptid-interaktioner 22. I själva verket har histonpeptidmikrorays uppstått som en informativ upptäcktsplattform för kromatinbiokemiforskning, vilket möjliggör hög genomströmningsprofilering av författarna, raderarna och läsarna av histon PTM 15 , 23, 24, och även för analys av histon antikroppsspecificitet 17, 25. Utöver deras tillämpning i kromatin och epigenetik forskning, histon peptid arrayer har potentiell användbarhet som ett diagnostiskt / prognostiskt test för systemisk lupus erythematosus och andra autoimmuna sjukdomar där anti- Kromatin-autoantikroppar genereras 26 , 27 .
Här beskriver vi en integrerad pipeline som vi har utvecklat för att designa, tillverka och queRita histonpeptidmikroarrays för att generera specificitetsprofiler för antikroppar som känner igen histoner och deras PTM. Ledningen underlättas av ArrayNinja, en öppen källkod, interaktiv programvara som vi nyligen utvecklat, vilket integrerar design och analysstadier av mikroarray-experiment 28 . ArrayNinja fungerar bäst i Google Chrome. I korthet används en robotkontakt-mikroarrayskrivare för att deponera ett bibliotek av biotinkonjugerade histonpeptider vid definierade positioner på streptavidinbelagda glasmikroskopskivor. Arrays kan sedan användas i ett kompetitivt och parallellt analysformat för att förhöra antikropp-epitopinteraktioner ( Figur 1 ). Peptidbiblioteket består av hundratals unika syntetiska peptider som innehåller PTM (lysinacetylering, lysin / argininmetylering och serin / treoninfosforylering) ensam och i relevanta kombinationer som i stor utsträckning härstammar från proteomikdataset. Metoder för peptidsyntes och validering Beskrivs annorstädes 23 . Data som genereras av våra pågående histon-PTM-antikroppsskärmningsansträngningar som utnyttjar denna arrayplattform arkiveras på en offentlig webbresurs, Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com). I synnerhet har histonpeptidmikroarrays tillverkad med variationer av detta protokoll också använts i stor utsträckning för att karakterisera aktiviteten hos histon-PTM-läsarens domäner 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 och mer nyligen för att profilera histon PTM-författare och suddgummi 24 .
/files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg "/>
Figur 1: Tecknadspåvisning av stegvis procedur för antikroppsscreening på en histonpeptid-mikroarray. Biotinylerade histonpeptider som innehåller definierade posttranslationella modifieringar (röda och blå cirklar) trycks med biotin-fluorescein på streptavidinbelagd glas. Positiva interaktioner visualiseras som röd fluorescens. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Antikroppsäkerhet i biomedicinska forskningsapplikationer är viktigast 46 , 47 . Detta gäller speciellt vid kromatinbiokemi med antistoffpositioner som viktiga verktyg för de flesta tekniker som utvecklats för att karakterisera överflöd och fördelning av histon-PTM. Protokollet presenterade här en optimerad pipeline för konstruktion, tillverkning och användning av peptidmikroarrays för att analysera histon PTM-antikroppsspecificitet. Denna rörlednin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av Van Andel Research Institute och ett forskningsbidrag från National Institutes of Health (CA181343) till SBR
Materials
| Printing Buffer | ArrayIt | PPB | |
| BSA | Omnipure | 2390 | |
| Streptavidin-coated glass microscope slides | Greiner Bio-one | 439003-25 | |
| polypropylene 384 well plate | Greiner Bio-one | 784201 | |
| Biotin-fluorescein | Sigma | 53608 | |
| contact microarray printer | Aushon | 2470 | Aushon 2470 Microarray Printer |
| contact microarray printer | Gene Machines | OmniGrid 100 | OmniGrid Microarray Printer |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Blocking Buffer | ArrayIt | SBB | |
| Hydrophobic wax pen | Vector Labs | H-4000 | ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen |
| Silicon Gasket | Grace Bio-labs | 622511 | |
| Hybridization Vessel | Thermo Scientific | 267061 | or similar vessel |
| Fluorescent-dye conjugated secondary antibody | Life Technologies | A-21244 | Alexa Fluor 647 (anti-rabbit) |
| Fluorescent-dye conjugated secondary antibody | Life Technologies | A-21235 | Alexa Fluor 647 (anti-mouse) |
| Wax Imprinter | ArrayIt | MSI48 | |
| Tween-20 | Omnipure | 9490 | |
| Microarray Scanner | Innopsys | InnoScan 1100AL | or equivalent microarray scanner |
| EipTitan Histone Peptide Microarray | Epicypher | 112001 | |
| AbSurance Pro Histone Peptide Microarray | Millipore | 16668 | |
| MODified Histone Peptide Array | Active Motif | 13001 | |
| Histone Code Peptide Microarrays | JPT | His_MA_01 | |
| Wax | Royal Oak | GulfWax | for wax imprinter |
| Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber | VWR | 97000-284 | |
| High throughput microscope slide washing chamber | ArrayIt | HTW | |
| Microscope slide centrifuge | VWR | 93000-204 | |
| Antibody 1 | Abcam | 8898 | |
| Antibody 2 | Millipore | 07-473 | |
| Biotinylated histone peptide | EpiCypher | 12-0001 | Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources. |
| ImageMagick | https://www.imagemagick.org/script/index.php | ||
| ArrayNinja | https://rothbartlab.vai.org/tools/ |
References
- van Steensel, B. Chromatin: constructing the big picture. EMBO J. 30 (10), 1885-1895 (2011).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Rothbart, S. B., Strahl, B. D. Interpreting the language of histone and DNA modifications. Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 627-643 (2014).
- Shogren-Knaak, M., Ishii, H., Sun, J. -. M., Pazin, M. J., Davie, J. R., Peterson, C. L. Histone H4-K16 acetylation controls chromatin structure and protein interactions. Science. 311 (5762), 844-847 (2006).
- Musselman, C. A., Lalonde, M. -. E., Côté, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
- Huang, H., Sabari, B. R., Garcia, B. A., Allis, C. D., Zhao, Y. SnapShot: Histone Modifications. Cell. 159 (2), 458 (2014).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Rothbart, S. B., Krajewski, K., et al. Association of UHRF1 with methylated H3K9 directs the maintenance of DNA methylation. Nat Struct Mol Biol. 19 (11), 1155-1160 (2012).
- Wang, Z., Zang, C., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nat Genet. 40 (7), 897-903 (2008).
- Stunnenberg, H. G., Hirst, M. The International Human Epigenome Consortium: A Blueprint for Scientific Collaboration and Discovery. Cell. 167 (5), 1145-1149 (2016).
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Egelhofer, T. A., Minoda, A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Bock, I., Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Brandt, O., Rathert, P., Jeltsch, A. Detailed specificity analysis of antibodies binding to modified histone tails with peptide arrays. Epigenetics. 6 (2), 256-263 (2011).
- Busby, M., Xue, C., et al. Systematic comparison of monoclonal versus polyclonal antibodies for mapping histone modifications by ChIP-seq. Epigenetics Chromatin. 9, 49 (2016).
- Fuchs, S. M., Krajewski, K., Baker, R. W., Miller, V. L., Strahl, B. D. Influence of combinatorial histone modifications on antibody and effector protein recognition. Curr Biol. 21 (1), 53-58 (2011).
- Kungulovski, G., Jeltsch, A. Quality of histone modification antibodies undermines chromatin biology research. F1000Research. 4, 1160 (2015).
- Rothbart, S. B., Dickson, B. M., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
- Rothbart, S. B., Lin, S., et al. Poly-acetylated chromatin signatures are preferred epitopes for site-specific histone H4 acetyl antibodies. Sci Rep. 2, 489 (2012).
- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nat Protoc. 4 (3), 393-411 (2009).
- Hu, S., Wan, J., et al. DNA methylation presents distinct binding sites for human transcription factors. eLife. 2, e00726 (2013).
- Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. Applications in high-content functional protein microarrays. Curr Opin Chem Biol. 30, 21-27 (2016).
- MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289 (5485), 1760-1763 (2000).
- Rothbart, S. B., Krajewski, K., Strahl, B. D., Fuchs, S. M. Peptide microarrays to interrogate the “histone code” . Methods Enzymol. 512, 107-135 (2012).
- Cornett, E. M., Dickson, B. M., et al. Substrate Specificity Profiling of Histone-Modifying Enzymes by Peptide Microarray. Methods Enzymol. 574, 31-52 (2016).
- Nady, N., Min, J., Kareta, M. S., Chédin, F., Arrowsmith, C. H. A SPOT on the chromatin landscape? Histone peptide arrays as a tool for epigenetic research. Trends Biochem Sci. 33 (7), 305-313 (2008).
- Dieker, J., Berden, J. H., et al. Autoantibodies against Modified Histone Peptides in SLE Patients Are Associated with Disease Activity and Lupus Nephritis. PLoS ONE. 11 (10), (2016).
- Price, J. V., Tangsombatvisit, S., et al. “On silico” peptide microarrays for high-resolution mapping of antibody epitopes and diverse protein-protein interactions. Nat Med. 18 (9), 1434-1440 (2012).
- Dickson, B. M., Cornett, E. M., Ramjan, Z., Rothbart, S. B. ArrayNinja: An Open Source Platform for Unified Planning and Analysis of Microarray Experiments. Methods Enzymol. 574, 53-77 (2016).
- Gatchalian, J., Fütterer, A., et al. Dido3 PHD modulates cell differentiation and division. Cell Rep. 4 (1), 148-158 (2013).
- Cai, L., Rothbart, S. B., et al. An H3K36 methylation-engaging Tudor motif of polycomb-like proteins mediates PRC2 complex targeting. Mol Cell. 49 (3), 571-582 (2013).
- Rothbart, S. B., Dickson, B. M., et al. Multivalent histone engagement by the linked tandem Tudor and PHD domains of UHRF1 is required for the epigenetic inheritance of DNA methylation. Genes Dev. 27 (11), 1288-1298 (2013).
- Ali, M., Rincón-Arano, H., et al. Molecular basis for chromatin binding and regulation of MLL5. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (28), 11296-11301 (2013).
- Kinkelin, K., Wozniak, G. G., Rothbart, S. B., Lidschreiber, M., Strahl, B. D., Cramer, P. Structures of RNA polymerase II complexes with Bye1, a chromatin-binding PHF3/DIDO homologue. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (38), 15277-15282 (2013).
- Klein, B. J., Piao, L., et al. The histone-H3K4-specific demethylase KDM5B binds to its substrate and product through distinct PHD fingers. Cell Rep. 6 (2), 325-335 (2014).
- Kim, H. -. S., Mukhopadhyay, R., et al. Identification of a BET family bromodomain/casein kinase II/TAF-containing complex as a regulator of mitotic condensin function. Cell Rep. 6 (5), 892-905 (2014).
- Greer, E. L., Beese-Sims, S. E., et al. A histone methylation network regulates transgenerational epigenetic memory in C. elegans. Cell Rep. 7 (1), 113-126 (2014).
- Andrews, F. H., Tong, Q., et al. Multivalent Chromatin Engagement and Inter-domain Crosstalk Regulate MORC3 ATPase. Cell Rep. 16 (12), 3195-3207 (2016).
- Sidoli, S., Lin, S., Karch, K. R., Garcia, B. A. Bottom-Up and Middle-Down Proteomics Have Comparable Accuracies in Defining Histone Post-Translational Modification Relative Abundance and Stoichiometry. Anal Chem. 87 (6), 3129-3133 (2015).
- Tsukada, Y., Ishitani, T., Nakayama, K. I. KDM7 is a dual demethylase for histone H3 Lys 9 and Lys 27 and functions in brain development. Genes Dev. 24 (5), 432-437 (2010).
- Tachibana, M., Sugimoto, K., Fukushima, T., Shinkai, Y. Set domain-containing protein, G9a, is a novel lysine-preferring mammalian histone methyltransferase with hyperactivity and specific selectivity to lysines 9 and 27 of histone H3. J Biol Chem. 276 (27), 25309-25317 (2001).
- Wu, H., Chen, X., et al. Histone methyltransferase G9a contributes to H3K27 methylation in vivo. Cell Res. 21 (2), 365-367 (2011).
- Koch, C. M., Andrews, R. M., et al. The landscape of histone modifications across 1% of the human genome in five human cell lines. Genome Res. 17 (6), 691-707 (2007).
- Okitsu, C. Y., Hsieh, J. C. F., Hsieh, C. -. L. Transcriptional Activity Affects the H3K4me3 Level and Distribution in the Coding Region. Mol Cell Biol. 30 (12), 2933-2946 (2010).
- Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Res. 21 (8), 1273-1283 (2011).
- Garske, A. L., Oliver, S. S., et al. Combinatorial profiling of chromatin binding modules reveals multisite discrimination. Nat Chem Biol. 6 (4), 283-290 (2010).
- Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
- Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 518 (7537), 27-29 (2015).
- Nguyen, U. T. T., Bittova, L., et al. Accelerated chromatin biochemistry using DNA-barcoded nucleosome libraries. Nat Methods. 11 (8), 834-840 (2014).
- Frank, R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).
- Hilpert, K., Winkler, D. F. H., Hancock, R. E. W. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat Protoc. 2 (6), 1333-1349 (2007).
- Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity analysis of protein lysine methyltransferases using SPOT peptide arrays. J Vis Exp. (93), e52203 (2014).
