É apresentado um método para criar e imagem viva diferentes meninos de medula óssea humanizados em camundongos. Com base no nicho de suporte criado por células mesenquimais humanas, a adição de células endoteliais humanas induz a formação de vasos humanos, enquanto que a adição de rhBMP-2 induz a formação de tecido ósseo maduro quimérico humano-rato.
As células estaminais hematopoiéticas humanas (HSCs) residem no nicho da medula óssea (BM), uma rede intrincada e multifatorial de componentes que produzem citoquinas, fatores de crescimento e matriz extracelular. A capacidade de HSCs para permanecer quiescente, auto-renovar ou diferenciar, e adquirir mutações e tornar-se maligno depende das interações complexas que eles estabelecem com diferentes componentes do estômago. Para observar a crosstalk entre HSCs humanos e o nicho de BM humano em condições fisiológicas e patológicas, elaboramos um protocolo para modelar ectopicamente e imagem de um nicho de BM humanizado em camundongos imunodeficientes. Mostramos que o uso de diferentes componentes celulares permite a formação de estruturas humanizadas e a oportunidade de sustentar o enxerto hematopoiético humano a longo prazo. Usando o microscópio de dois fótons, podemos viver a imagem dessas estruturas in situ com a resolução de célula única, fornecendo uma nova e poderosa ferramenta para a caracterização funcional do BM humanoIcroambiente e seu papel na regulação da hematopoiese normal e maligna.
As decisões do destino das células observadas nos compartimentos das células estaminais são rigorosamente reguladas por fatores intrínsecos e extrínsecos. Em particular, agora é amplamente reconhecido que o microambismo do BM desempenha um papel fundamental no controle da mudança em HSCs de um estado quiescente para um estado ativo, bem como em sua decisão de destino de auto-renovação ou diferenciação 1 . Além disso, descobertas recentes indicam que as neoplasias hematológicas afetam a função do microambiente BM, apontando para a existência de crosstalk ativo entre os dois compartimentos 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Apesar dos avanços recentes, muitas questões-chave continuam a ser sobre como a atividade de componentes específicos do nicho de BM contribuem para o comportamento de HSC e para a transformação maligna.
O microambiente do BM é um heterogêneo Mistura eneous e complexa de muitos tipos de células diferentes, cada uma com funções especializadas. O abundante componente endotelial (EC) e vascular regulamentações de nutrientes e metabolitos, a entrada e a saída de diferentes células para e do BM, e várias funções de HSC 7 , 8 . As células do estroma mesenquimatosas (MSCs), uma população heterogênea de células estaminais indiferenciadas e progenitores comprometidos através de três linhagens diferentes ( ie osteogênicas, condrogênicas e adipogênicas) são outro componente fundamental do nicho BM. Esses MSCs localizam ambas nas áreas centrais do BM e na proximidade da região endosteal. Eles podem estar associados a estruturas vasculares e estão implicados na regulação da função HSC 9 , 10 , 11 , 12 , 13 ,"> 14 , 15 .
Muitos relatórios sugerem que HSCs residem em vários sites definidos dentro da medula e que sua função pode depender de sua localização precisa. A maioria dos conhecimentos atuais sobre HSCs e sua interação com o microambiente BM derivam de estudos murinos 1 . O uso de modelos de xenoenxerto ampliou esse conhecimento para HSCs normais e malignos humanos, injerindo dentro da BM murina de camundongos imunodeficientes 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Embora isso represente um modelo válido, ele ainda apresenta muitos desafios, como a necessidade de condicionar o mouse receptor na maioria dos casos para permitir o acesso e o enxerto HSC humano ou a barreira das espécies cruzadas e sua influência mal compreendida nas interações célula-célula e funções.
O uso de anticorpos neutralizantes e ratos geneticamente modificados, juntamente com o xenotransplante, tem sido fundamental para destacar o diálogo complexo que os HSCs humanos estabelecem com seus microambientes. A introdução eo desenvolvimento da microscopia confocal intravital de dois fótons movimentou esses estudos um passo adiante, permitindo a imagem direta, de alta resolução e dinâmica da medula óssea 19 , 20 , 21 , 22 e fornece uma ferramenta poderosa para o funcionamento Caracterização do microambiente BM e seu papel na regulação da função HSC. A fim de contornar alguns dos problemas que surgem nos modelos clássicos de xenotransplante, o conceito de engenharia de uma estrutura BM humanizada foi trazido à tona. Combinando biomateriais e conceitos de implantação celular, os relatórios mostraram a viabilidade de imitar o osso humano mMicroambiente de flecha em regiões heterotópicas 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Isso abre a possibilidade de usar a bioengenharia em modelos de ratos para estudar hematopoiese normal e maligna humana 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , tumorigênese e metástases 40 , 41 , 42 , 43, 44.
Com base na experiência anterior na engenharia de tecidos ósseos e imagens in vivo 19 , 22 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 , descrevemos um protocolo para bioengenharia e tecidos organotípicos de BM organiograficos de imagem ao vivo. Essas estruturas são originárias da implantação de células de estroma derivadas de BM humanas em andaimes à base de colágeno subcutaneamente enxertados em camundongos imunodeficientes. Em um relatório anterior, demonstramos que os MSCs humanos asseguram a formação de um microambiente humano adequado para o enxerto de células hematopoiéticas humanas 45 . Além disso, aqui descrevemos como a co-implantação de outro componente celular BM humanoS, como células endoteliais humanas (hEC) e / ou citocinas importantes para a formação óssea ( por exemplo, hBMP2), cooperam com hMSCs para gerar diferentes microambientes humanizados, que podem ser filmados ao vivo in situ .
Significado do respeito aos métodos existentes:
Neste protocolo, descrevemos um método para gerar diferentes microambientes humanizados em camundongos e para visualizar sua arquitetura através de microscopia e histologia de dois fótons. Os dados representativos fornecidos mostram a viabilidade da abordagem, utilizando diferentes células estromadas para engenharia de tecidos humanizados. O protocolo tem aplicações específicas para o estudo de células hematopoiéticas humanas e células derivadas de nódulos da medula óssea em condições normais e patológicas. Essas aplicações incluem o estudo da evolução clonal, triagem de drogas e crosstalk entre HSC humanos e componentes estromais. No campo emergente da engenharia de tecidos, várias abordagens alternativas foram propostas. As abordagens da nota incluem o desenvolvimento de estruturas 3D humanizadas 3D in vitro 55 , 56 , 57 ,S = "xref"> 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63 e o enxerto ortotópico de andaimes BM humanizados em camundongos 64 . Nossa abordagem tem a vantagem de combinar a complexidade do sistema in vivo com a acessibilidade anatômica fácil do enxerto de tecido humanizado.
Modificações e Solução de Problemas:
Uma fonte de variabilidade neste protocolo pode ser encontrada na seleção de células usadas para semear os andaimes. Em nosso trabalho, utilizamos os hMSC derivados do BM. No entanto, as células mesenquimais podem ser obtidas a partir de vários tecidos, o que pode mostrar propriedades distintivas dependendo da origem. Portanto, o uso de hMSCs derivados de diferentes órgãos pode ser considerado. No entanto, a sua capacidade de formar tecido ósseo in vivo deve ser testada antes da utilização nesta pEste protocolo usa uma fonte de células endoteliais humanas comercialmente disponível ( ou seja, HUVEC transduzida com E4ORF1). Recentemente, o uso de células endoteliais específicas de órgãos para diferentes propósitos foi relatado 65 , 66 . Além disso, o uso de primarias primárias derivadas do BM poderia representar uma melhoria interessante para o protocolo. Portanto, o uso de diferentes fontes de células endoteliais pode produzir diferentes resultados in vivo .
Utilizamos ratos receptores imunocomprometidos NSG para favorecer a implantação de andaimes humanizados e evitar a rejeição tecidual. Não excluímos a possibilidade de usar este protocolo para engenharia de tecidos ectópicos de medula óssea em outras cepas de mouse. De fato, rhBMP-2 pode induzir a formação óssea em diferentes modelos de mamíferos 47 , 48 , 49 , 50 <sup>, 52 . No entanto, as diferenças na viabilidade celular e no transplante a longo prazo provavelmente serão observadas usando diferentes cepas / modelos.
O tempo de recuperação do andaime também pode ser flexível, dependendo do propósito final da experiência. No protocolo apresentado, recuperamos amostras às 8 a 12 semanas após a implantação para avaliar o enxerto hematopoiético de longo prazo. Para estudar os primeiros passos da formação de nicho BM humano ( por exemplo, formação de tecido osteocondral 47 ou desenvolvimento vascular), diferentes pontos de tempo podem ser escolhidos.
A técnica de imagem ao vivo que descrevemos neste protocolo é indicada para imagens de curto prazo de explantes. O uso de uma câmara equilibrada para manter a temperatura fisiológica, a tensão do oxigênio e a concentração de CO 2 deve ser considerado em casos de imagem de longo prazo, como estudar comportamentos de motilidade.
St críticoEps dentro do protocolo:
Entre os desafios relacionados ao protocolo, destacamos as habilidades técnicas necessárias para algumas etapas. As células mesenquimatosas e endoteliais devem ser usadas em números de passagem de células baixas; Caso contrário, eles não serão capazes de suportar o enxerto de células hematopoiéticas humanas in vivo ou participar de formação de novo e formação óssea in vivo . Recomendamos o uso de hMSCs e hECs nas passagens 1 – 5. A preparação do andaime e as etapas de semente celular requerem habilidades básicas de cultura celular e conhecimento das propriedades das células específicas usadas no procedimento. O protocolo de cirurgia é bastante direto, mas requer alguma prática. A manutenção de um ambiente asséptico para evitar a contaminação dos andaimes implantados em camundongos imunodeficientes é crucial para garantir o sucesso do experimento. O explante de amostras e a imagem ao vivo requerem prática cirúrgica (especialmente para o uso da microdrill) e conhecimento daSistema de microscópio. Finalmente, processamento de amostras e histologia exigem conhecimento básico das técnicas a serem utilizadas.
Limitações da técnica:
A abordagem que descrevemos permite a visualização de células hematopoiéticas humanas vivas que semeiam um microambiente humanizado da medula óssea, com células endoteliais humanas formando estruturas vasculares e células mesenquimais formando espaço ósseo / medula óssea. À medida que o tecido é formado in vivo , o andaime de engenharia final ainda será quimérico (humano e murino). Esta questão deve ser levada em consideração, já que o tecido quimérico pode não imitar completamente a complexidade e o meio da medula óssea humana.
Os andaimes implantados têm um tamanho limitado (tentamos um máximo de 6,6 x 7,5 x 7 mm) e, portanto, eles são capazes de hospedar um número limitado de células para o xenotransplante. O número absoluto de células recuperadas também será limitado; Assim, o número de andaimes implantados deveSer calculado como uma função do número de células necessárias para a experiência.
O aplicativo de imagem que descrevemos é particularmente útil para observar grandes áreas de tecido vivo em profundidades de 150-200 μm da superfície sem interromper a arquitetura e danificar as células. Portanto, não permite a visualização de todo o andaime. Se for necessária uma varredura completa do tecido, as abordagens padrão de imunofluorescência seriam mais apropriadas.
Futuras Aplicações:
A direção futura desse modelo de bioengenharia seria aumentar a complexidade dos componentes humanos no tecido. O conhecimento e a caracterização do nicho BM humano progrediram nos últimos anos 67 e o protocolo descrito pode ser uma plataforma interessante para estudar a função desses novos componentes celulares e fatores solúveis, bem como seu papel no suporte normal / malignoHSCs formigas.
Além disso, a técnica de imagem fornece o potencial de imagem intravítica dos andaimes em estudos longitudinais, o que exigiria melhorias técnicas na imagem dos andaimes em ratos vivos anestesiados, com recuperação pós-cirúrgica. Esta abordagem exigiria etapas adicionais e está atualmente sob investigação no laboratório.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a equipe nas principais instalações do Instituto Francis Crick (Instalações de Pesquisa Biológica, In Vivo Imaging e Histopathology Experimental) e Yolanda Saavedra-Torres e Mercedes Sanchez-Garzon, os veterinários da Crick e LRI, respectivamente, por sua valiosa ajuda. Agradecemos ao Dr. W. Gray pela leitura crítica do manuscrito. A DP foi apoiada por uma bolsa de pesquisa não-clínica da EHA. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Francis Crick, que recebe o seu financiamento principal da Cancer Research UK (FC001045), do Conselho de Pesquisa Médica do Reino Unido (FC001045) e do Welcome Trust (FC001045).
Ficoll-Paque | Ge Healthcare | 17-1440-03 | |
Cd34 positive selection Kit | Stemcell | 18056 | Store a 4°C. |
Magnet | Stemcell | 18000 | |
Anti-human CD3 antibody, clone OKT-3 | Bioxcell | BE0001-2 | Store at 4°C. Used for T cell depletion in primary AML samples. |
Cytokines (IL3, G-CSF, and TPO) | PeproTech | 200-03, 300-23 and 300-18 | For doing the stock: Dilute each one of the cytokines in 100μL of water and mix them. Add 200μL, do alicuots of 45μL and Store at -20°C. |
DMSO | Sigma | D4540 | |
FBS | Life technologies | 10270106 | Heat-inactivate at 56°C during 30 minutes, do aliquots and freeze down. Warm in 37°C water bath before use. |
MEM-α | Invitrogen | 32571-028 | Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use. |
Myelocult H5100 | corning | 5100 | Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use. |
199 | Gibco | 41150-020 | Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use. |
hMSC-FBS, Heat-inactivated | Gibco | 12662-029 | Store at -20°C. Warm in 37°C water bath before use. |
P/S | Sigma-Aldrich | P0781 | Store at -20°C. Warm in 37°C water bath before use. |
ECGS | Millipore | 02-102 | Dilute in culture media and use 0.22 mm filter. |
HEPES | Sigma-Aldrich | S1558-50ML | Store at 4°C. |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | Store at 4°C. |
Glutamine | Gibco | 25030 | Store at -20°C. |
Collagen 1 coated cell culture plate | corning | 354505 | |
Trypsin-EDTA solution | Thermo-Fisher | 25200056 | Store at -20°C. Warm in 37°C water bath before use. |
hMSC | Lonza | PT-2501 | Alternatively, hMSCs we also kindly provided by Dr. Dosquet (University Paris Diderot, Paris) from human bone marrow obtained during orthopaedic surgery under ethical approval 10-038 from IRB00006477. |
VeraVec HUVEC endothelial cells | Angiocrine bioscience | hVera101 | |
Human hematopoietic cells | Umbilical Cord blood or primary Acute Myeloid Leukemia (AML) samples were obtained from the Royal London Hospital (London, UK) after informed consent and protocol of use was approved by the East London Ethical Committee and carried out in accordance with the Declaration of Helsinki. | ||
Gelfoam, Size 12-7mm | Pfizer | 00009-0315-08 | |
PBS | Thermo-Fisher | 10010023 | |
Surgical material | Multiple | Sterile forceps, tweezers and sharp scissors. | |
Sterile tissues | Heat-sterilize paper tissues. | ||
1 ml Syringe with needle of 25G | Terumo | SS+01H25161 | |
Ultra Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3473 or 3471 | |
BMP2 | Noricum | rhBMP-2 | Dilute at 5 mg/ml in acetic acid 50 mM and store at 4 °C. |
Thrombin | Sigma | T9010 | Dilute in CaCl2 2%, 500 mL per vial, and store at 4 °C. |
Fibrinogen | Sigma | F3879 | Dilute at 4 mg/100 mL in PBS. Store at -20C. Warm before use. |
Tissue-culture dishes 35 mm x 10 mm | Falcon | 353001 | |
U-Botton 96 well plate | Falcon | 353077 | |
NSG mice | The Jackson Laboratory | 5557 | NSG mice were a kind gift from Dr Leonard Shultz (The Jackson Laboratory). |
Chlorhexidine | G9 | Dilute 1:10 before use | |
Carprofen | Pfizer | Rimadyl | 5 mg/g of mouse |
Buprenorphine | Alstoe | Vetergesic | 0.1 mg/g of mouse body weight |
Isoflurane | Abbott | B506 | Induction of anaesthesia 2%, maintenance 1% |
Trimmer | Wella | Contura HS61 | |
Surgical glue | 3M | Vetbond | |
carbomer (polyacrylic acid) as Ophthalmic gel | Novartis | Viscotears Liquid Gel | |
Human Normal Immunoglobulin | Gammaplex | 10g vial | 100 ml/mouse intravenously, 30 min before infusion of specific antibody. |
NT-QTracker | Invitrogen | Q21021MP | Vessel-pooling agent. Administrate 15 ml/mouse intravenously 5 min before imaging. |
AF488-hCD45 | Biolegend | 304017 | 100 ml/mouse intravenously, 30 min before imaging. |
FITC-hCD31 | BD Pharmigen | 555445 | 100 ml/mouse intravenously, 30 min before imaging. |
Super glue | Loctite | Super Glue | |
Micro-Drill Kit | IDEAL – Fisher Scientific | NC9010016 | |
Microsurgical microscope | No specific brand/company is adviced. | ||
LSM 710 NLO | Zeiss | Upright confocal microscope with motorized stage, two-photon laser and 20x 1.0 NA water immersion lens. Alternatively, a microscope with similar specifications could be used. | |
MaiTai “High Performance” fully automated 1-box 517 mode-locked Ti:Sapphire laser with DeepSee dispersion compensation | Spectra-Physics | ||
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 32294 | |
Osteosoft | Millipore | 1.01728.1000 | |
Polysine slices | Thermo scientific | J2800AMNZ | |
Antigen unmasking solution | Vector | H-3300 | Store at 4 °C. Dilute 1:100 in H2O for working solution. |
Triton 100x | Sigma-Aldrich | T9284 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A96470 | Store at 4 °C. |
Normal Goat serum (NGS) | Sigma-Aldrich | G9023 | Store at 4 °C. |
Endomucin Antibody | Santa Cruz | sc-65495 | Store at 4 °C. |
hVimentin antibody | Santa Cruz | sc-6260 | Store at 4 °C. |
hCD31 antibody | DAKO | M0823 | Store at 4 °C. |
hCD45 antibody | DAKO | M0701 | Store at 4 °C. |
ADRP (Perilipin2) | antibodies-online | ABIN283918 | Store at 4 °C. |
Goat anti mouse secondary antibodies | Invitrogen | A11029 or A11005 | Store at 4 °C. |
Goat anti Rabbit secondary antibodies | Invitrogen | A11037 or A11008 | Store at 4 °C. |
Goat anti Rat secondary antibodies | Invitrogen | A11007 or A21247 | Store at 4 °C. |
Sudan Black | Sigma | S2380 | Prepare a stock of 1% sudan black in ethanol 70%. Store at RT. Prepare working solution of 0.1% sudan black in ethanol 70% and filter using filter-paper before use. |
DAPI | Sigma | D8417 | Prepare stock in H20 at 100 mg/mg. Store at 4 °C. |
Fluorescent mounting media | Dako | S3023 | Add DAPI before use (1:400 from DAPI stock). |
Cover glass | VWR | 631-0147 |